任务三 病毒的致病性及实验室诊断
一、病毒的致病性
（一）对宿主细胞的致病作用
1.干扰宿主细胞的功能
（1）抑制或干扰宿主细胞的生物合成。大多数杀伤性病毒所转译的早期蛋白质可抑制宿主细胞RNA 的蛋白质的合成，随后DNA 的合成也受到抑制。如小RNA 病毒、疱疹病毒和痘病毒。
（2）破坏宿主细胞的有丝分裂。病毒在宿主细胞内复制，能干扰宿主细胞的有丝分裂，形成多核的合胞体或多核巨细胞。如疱疹病毒、痘病毒和副黏病毒。
（3）细胞转化。病毒的DNA 与宿主细胞的DNA 整合，从而改变宿主细胞遗传信息的过程，称为转化。转化后的细胞具有高度生长和增殖的势能，分裂周期缩短，并能持续地旺盛生长，这种转化后的细胞在机体内可能形成肿瘤。如乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒、反转病毒等。
（4）抑制或改变宿主细胞的代谢。病毒进入宿主细胞后，其DNA 能在几分钟内对宿主细胞DNA 的合成产生抑制，同时，病毒抢夺宿主细胞生物合成的场地、原材料和酶类，产生破坏宿主细胞DNA 及代谢酶的酶类，或产生宿主细胞代谢酶的抑制物，从而使宿主细胞的代谢发生改变或受到抑制。
2.损伤宿主细胞的结构
（1）细胞病变。病毒在宿主细胞内大量复制时，其代谢产物对宿主细胞具有明显的毒性，能导致宿主细胞结构的改变，出现肉眼或镜下可见的病理变化，即细胞病变。如空斑形成、细胞浊肿。
（2）包涵体形成。新复制的子病毒及其前体在宿主细胞内大量堆积，形成镜下可见的特殊结构，称为包涵体；或病毒在宿主细胞内复制时，形成病毒核配和蛋白质集中合成和装配的场所，即“病毒工厂”，也是一种镜下可见的细胞内的特殊结构，又称包涵体。
（3）溶酶体的破坏。某些病毒进入宿主细胞后，首先使宿主细胞溶酶体膜的通透性升高，进而使溶酶体膜破坏，溶酶体被释放而使宿主细胞发生自溶。
（4）细胞融合。病毒破坏溶酶体使宿主细胞发生自溶后，溶酶体酶被释放到细胞外，作用于其他细胞表面的糖蛋白，使其结构发生变化，从而使相邻细胞的胞膜发生融合，形成合胞体。
（5）红细胞凝集和溶解。某些病毒的表面具有一些称为凝血原的特殊结构，能与宿主红细胞的表面受体结合，使红细胞发生凝集，称为病毒的凝血作用，如新城疫病毒、流行性感冒病毒、狂犬病病毒；还有些病毒能溶解宿主的红细胞，称为病毒的溶血作用，如新城疫病毒、流行性感冒病毒。
3.引起宿主细胞死亡和破裂崩解
病毒在宿主细胞内复制，一方面，病毒粒子及病毒代谢产物对宿主细胞的结构，严重干扰宿主细胞的正常生命活动，引起宿主细胞的死亡；另一方面，不完全病毒在宿主细胞内复制出大量的子病毒后，以宿主细胞破裂的方式释放，造成宿主细胞死亡。
（二）对宿主机体的致病作用
1.病毒直接破坏机体的结构
病毒对机体结构的破坏，是以其对宿主细胞的损伤为基础的。有些病毒能破坏宿主毛细血管内皮和基底膜，造成其通透性增高，导致全身性出血、水肿、局部缺氧和坏死，如猪瘟病毒、新城疫病毒、马传染性贫血病毒；有些病毒能在宿主血管内产生凝血作用，导致机体微循环障碍，严重者发生休克，如新城疫病毒、流行性感冒病毒；有些病毒则通过细胞的转化形成肿瘤，与其他健康组织争夺营养并对其周围组织造成压迫，使健康组织萎缩，机体消瘦，如鸡马立克氏病病毒、牛白血病病毒、禽白血病病毒；有些病毒能破坏神经细胞的结构，引发机体的神经细胞结构和神经症状，如狂犬病病毒；有些病毒能破坏肠黏膜柱状上皮，使小肠绒毛萎缩，影响营养和水分的吸收，引起剧烈的水样腹泻，如猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒。
2.病毒的代谢产物对机体的致病作用
病毒在复制的过程中能产生一些健康动物体内没有的代谢产物，这些代谢产物与宿主体内的某些功能物质结合而影响这些物质的功能发挥，或吸附于某些细胞的表面，改变细胞表面的抗原性，激发机体的变态反应而造成组织损伤，如水貂阿留申病病毒、马传染性贫血病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒。代谢产物还可通过改变机体的神经体液功能而发挥致病作用。
病毒在破坏宿主细胞的过程中能释放出一些病理产物，这些病理产物可继发性地引起机体的结构和功能破坏。例如：细胞破裂后释放出来的溶酶体酶，可造成组织细胞的溶解和损伤；5-羟色胺、组胺、缓激肽等可引发局部炎症反应。
二、病毒感染的实验室诊断方法
畜禽病毒性传染病是危害最严重的一类疫病，给畜牧业带来的经济损失最大。除少数病毒病（如绵羊痘等）可根据临床症状、流行病学、病变作出诊断外，大多数病毒性传染病的确诊必须在临床诊断的基础上进行实验室诊断，以确定病毒的存在或检出特异性抗体。病毒病的实验室诊断和细菌病的实验室诊断一样，都需要正确地采集病料，常用的诊断方法有病毒的分离培养、病毒的血清学试验、动物接种试验、分子生物学的方法等。
（一）病料的采集、保存和运送
病料采集适当与否，直接影响病毒的检测结果。一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或粪便等，采样因动物及病毒的种类而异。例如：因犬细小病毒或轮状病毒导致腹泻的幼犬或犊牛，一般应采其粪便；怀疑为口蹄疫的猪或牛，则应采其水疱液及水疱皮送检。
病毒病料采集的原则、方法以及保存运送的方法与细菌病病料的采集、保存和运送方法基本是一致的，不同的是病毒材料的保存除可冷冻外，还可放在50%甘油磷酸盐缓冲液中保存，液体病料采集后可直接加入一定量的青霉素、链霉素或其他抗生素，以防细菌和霉菌的污染。
（二）病毒的分离和培养
细胞培养、禽胚和实验动物可用于病毒的分离和培养，其中细胞培养是用于病毒分离和培养最常用的方法。供接种或培养的病料应作除菌处理。除菌方法有细菌滤器除菌、高速离心除菌和用抗生素处理3 种。如用口蹄疫的水疱皮进行病毒分离培养时，将送检的水疱皮置平皿内，以灭菌的pH 值为7.6 的磷酸盐缓冲液洗涤数次，并用灭菌滤纸吸干、称重，剪碎、研磨制成1∶5悬液，为防止细菌污染，每毫升加青霉素1 000 U、链霉素1 000 μg，置2～4 ℃冰箱内4～6 h，然后用8 000～10 000 r/min 离心沉淀30 min，吸取上清液备用。
被接种的动物、禽胚或细胞出现死亡或病变时（但有的病毒须盲目传代后才能检出），可应用血清学试验及相关技术进一步鉴定病毒。
（三）动物接种试验
病毒病的诊断也可应用动物接种试验来进行。取病料或分离到的病毒处理后接种实验动物，通过观察记录动物的发病时间、临床症状及病变甚至死亡的情况，也可借助一些实验室的方法来检测病毒的存在。此方法尤其在病毒毒力测定上应用广泛。
（四）病毒的血清学试验
病毒分离后，可用已知的抗病毒血清或单克隆抗体，对分离毒株进行血清学鉴定，以确定病毒的种类、血清型及其亚型。常用的血清学试验方法有血清中和试验、血凝抑制试验、补体结合试验、免疫沉淀技术和免疫转印技术等。
（五）分子生物学方法
分子生物学诊断已广泛应用于病毒的鉴定，又称基因诊断，主要是针对不同病原微生物所具有的特异性核酸序列和结构进行测定。其特点是反应灵敏度高、特异性强，检出率高，是目前最先进的诊断技术之一。主要的方法包括病毒基因的PCR 扩增（PCR 技术）及其序列分析、核酸杂交和DNA 芯片技术。
1.PCR 诊断技术
PCR 技术又称聚合酶链式反应，目前广泛用于病毒核酸检测。该方法是根据GenBank中病毒保守序列设计PCR 引物，以待检病毒核酸为模板（称为模板DNA），在DNA 聚合酶作用和适当条件下，置于PCR 仪，经变性、退火、延伸等基本步骤的多次循环，最后获得所扩增的目的基因片段，结果与已知病毒序列进行比对，即可得出结论。
PCR 可直接用于DNA 病毒的检测，如果是RNA 病毒，则需在扩增之前进行反转录，即提取病毒RNA，加入反转录酶合成cDNA 后，再进行PCR 扩增，称为反转录-聚合酶链式反应（简称RT-PCR）。
PCR 结合序列测定，不仅可用于病毒核酸的检测，还可用于新病毒的鉴定、病毒的分子流行病学研究等，特别适用于那些尽量减少散毒风险不宜进行的高致病性病毒（如口蹄疫病毒、高致病性禽流感病毒等），或不能适应细胞培养的病毒（如猪戊型肝炎病毒等）。
从PCR 技术发展起来的原味PCR 和荧光定量PCR，近年来也逐渐用于动物病毒的检测和病毒病的诊断。
2.核酸杂交
核酸杂交包括DNA 杂交和RNA 杂交。DNA 杂交用于检测病毒DNA，DNA 样本经限制性内切酶消化、凝胶电泳、变性，转移到滤膜上，然后用放射性同位素标记的病毒核酸序列探针检测结合到固相滤膜上的DNA。目前放射性同位素标记的核酸探针很少使用，大多用非放射性标记探针（生物素标记）进行检测。经过改良的斑点杂交，可用于样本中病毒核酸的快速检测。RNA 杂交，用于病毒RNA 的检测，基本过程与DNA 杂交相似。
核酸杂交技术可用于细胞、组织中病毒基因组或转录产物的定位检测，称为原位杂交。
3.DNA 芯片
DNA 芯片技术是一类新型的分子生物学技术，为研究细胞中病毒感染的基因表达谱提供了重要的新的手段，近年来也开始应用于病毒的检测和病毒病的诊断。该技术是将病毒DNA 片段有序地固化于支持物（如玻片、硅片）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测样本中的靶分子杂交，通过特定的仪器（如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测分析，从而可检测样本中靶分子的数量。该技术可用于大批量样本的检测和不同病毒病的鉴别诊断。