实训8 抗菌药物敏感性试验
一、目的要求
（1）理解生物化学因素对细菌的影响。
（2）掌握抗生素体外抗菌试验试纸片法的操作程序和结果判定方法。
（3）掌握最低抑菌浓度测定方法及意义。
二、基本原理
细菌药物敏感性试验是指在体外测定药物抑菌或杀死细菌的能力，可以为临床治疗感染性疾病选择敏感药物，也可了解细菌耐药情况。药敏试验的方法很多，通常使用的有纸片扩散试验和最低抑菌浓度试验（MIC）等。
1.纸片扩散试验
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种试验菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围扩散形成递减的浓度梯度。在纸片周围若试验菌生长被抑制，就会形成透明的抑菌圈。抑菌圈越大，说明试验菌对该药物越敏感；反之，则不敏感。
2.最低抑菌浓度试验
培养基内待测药物的含量按几何级数量稀释并接种适量的细菌，经培养后，观察抑菌作用，凡能抑制试验菌生长的最高药物稀释度为该药的最低抑菌浓度。
三、仪器及材料
（1）菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门氏菌等。
（2）培养基：适合试验菌生长的琼脂平板培养基、普通肉汤培养基。
（3）溶液及试剂：药敏试纸、含青霉素64 IU/mL 的普通肉汤。
（4）仪器或其他用具：恒温培养箱、培养皿、接种环、1 mL 刻度无菌吸管、游标卡尺、镊子、记号笔等。
四、方法与步骤
1.纸片扩散试验
（1）用灭菌过的棉拭蘸取试验菌（应含0.5 个麦氏单位的菌浓度）均匀涂抹在琼脂培养基表面，室温下放置数分钟使菌吸附。
（2）以无菌镊子取各种药敏试纸，贴放于已接种过试验菌的平板培养基表面，每个平板贴4～7 片，轻压试纸使其与琼脂适当接触。纸片与纸片之间的距离要相等且纸片之间圆心距应大于3 cm，也不可太靠近培养皿边缘，如图1.23 所示。
图1.23 药物敏感试验试纸片的贴法
（3）37 ℃培养24 h，观察结果。根据纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，按下列标准确定细菌对抗生素等药物的敏感度（表1.7）。
表1.7 药物抑菌判定标准（CLSI）2005
续表
2.最低抑菌浓度试验
（1）取灭菌小试管9 支置于试管架上，再以无菌操作每管加液体培养基1 mL。
（2）无菌操作吸取抗菌药物稀释液1 mL，放入第1 管中，混匀后吸取1 mL，放入第2 管中，混匀后吸取1 mL 放入第3 管中，如此逐管倍量稀释到第8 管，混匀后吸取1 mL。弃去。9 管不加抗菌药物作对照。操作术式见表1.8。
表1.8 MIC 术式表
（3）每管加被检细菌液体培养物稀释液各0.1 mL，一般接种菌液量为每毫升药液含103～105 个细菌，混匀后37 ℃培养16～24 h，特殊试验菌可适当延长培养时间，观察结果。
五、实验结果
（1）分别测量各种抗生素纸片抑菌圈直径（以mm 表示）。根据药物纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，来判断该菌对各种药物的敏感程度。一般情况下，抑菌圈越大，表示该药物抑菌作用越强，即此菌对该药敏感程度越高。
（2）以药物最高稀释管中无细菌生长者，该管的浓度即为该菌对此药物的敏感度，即MIC。
六、注意事项
（1）接种菌时要涂抹均匀，并放室温干燥。
（2）注意药敏试纸有效期，纸片周围要有一定的空间。
（3）逐管倍量稀释时应注意混匀。