任务二　细菌的生理

任务二　细菌的生理

细菌与其他生物一样，能进行复杂的新陈代谢，从环境中摄取营养物质，用以合成菌体本身的成分或获得生命活动所需的能量，排出代谢产物。不同细菌在其生理活动的过程中呈现某些特有的生命现象，因此，细菌的生长特征、代谢产物等常作为鉴别细菌的重要依据。

一、细菌的营养

组成细菌细胞的营养元素类似于动物细胞，但通过对细菌新陈代谢的研究，我们知道细菌利用各种化合物作为能源的能力远远大于动物细胞，而细菌对营养的需求比动物细胞更为多样，其特有的代谢过程也合成了许多不同于动物细胞的成分，如肽聚糖、脂多糖、磷壁酸等。

（一）细菌的营养物质

各类细菌对营养物质的要求差别很大，包括水、碳源、氮源、无机盐和生长因子等。其主要营养元素及其生理功能见表1.1。

1.水

细菌湿重的80%～90%为水。细菌代谢过程中所有的化学反应、营养的吸收和渗透、分泌、排泄均需有水才能进行。

2.碳源

各种无机或有机的含碳化合物（CO2、碳酸盐、糖、脂肪等）都能被细菌吸收利用，作为合成菌体所必需的原料，同时也作为细菌代谢的主要能量来源。致病性细菌主要从糖类中获得碳，己糖是组成细菌内多糖的基本成分，戊糖参与细菌核酸组成。

3.氮源

从分子态氮到复杂的含氮化合物都可被不同的细菌利用。但多数病原菌是利用有机氮化合物如氨基酸、蛋白胨作为氮源。少数细菌（如固氮菌）能以空气中的游离氮或无机氮（如硝酸盐、铵盐等）为氮源，主要用于合成细胞质及其他结构成分。

4.无机盐

钾、钠、钙、镁、硫、磷、铁、锰、锌、钴、铜、钼等是细菌生长代谢中所需的无机盐成分。除磷、钾、钠、镁、 硫、铁需要量较多外，其他只需微量。

各类无机盐的作用：构成菌体成分；调节菌体内外渗透压；促进酶的活性或作为某些辅酶组分；某些元素与细菌的生长繁殖及致病作用密切相关。

5.生长因子

很多细菌在其生长过程中还必须一些自身不能合成的化合物质，称为生长因子。生长因子必须从外界得以补充，其中包括维生素、某些氨基酸、脂类、嘌呤、嘧啶等。各种细菌对生长因子的要求不同，如大肠杆菌很少需要生长因子，而有些细菌（如肺炎球菌）则需要胱氨酸、谷氨酸、色氨酸、天冬酰胺、核黄素、腺嘌呤、尿嘧啶、泛酸、胆碱等多种生长因子。

（二）细菌的营养物质吸收与运转

细菌的细胞膜具有选择性透过物质的作用，这对保证细菌有一个稳定的内在环境及在生长过程中不断获得各类营养物质十分重要。

水和小分子溶质可经过半透膜性质的细胞壁及细胞膜进入菌体。大分子的营养物质（如蛋白质、多糖和脂类）必须在细菌分泌的胞外酶作用下，分解为小分子可溶性物质后才被吸收。

营养物质进入菌体的方式有简单扩散、促进扩散、主动运输及基团转位。

1.简单扩散

简单扩散又称易化扩散、被动扩散，是细胞内外物质最简单的交换方式。细胞膜两侧的物质靠浓度差进行分子扩散，不需消耗能量。某些气体（CO2）、水、乙醇及甘油等水溶性小分子以及某些离子（Na +）等可进行单纯扩散。单纯扩散无选择性，速度较慢，细胞内外物质浓度达到一致，扩散便停止，因此不是物质运输的主要方式。

2.促进扩散

促进扩散也是靠浓度差进行物质的运输，不需消耗能量，但与单纯扩散不同的是，促进扩散同时需要专一性载体蛋白。载体蛋白位于细胞膜上，糖或氨基酸等营养物质与载体蛋白结合，然后转运至细胞内。促进扩散具有特异性。

3.主动运输

主动运输是细菌吸收营养的一种主要方式，与促进扩散一样，需要特异性的载体蛋白，但被运输的物质可逆浓度差“泵”入细胞，因此需要消耗能量。细菌在生长过程中所需要的氨基酸和各种营养物质，主要是通过主动运输方式摄取的。

4.基团转位

基团转位与主动运输相似，同样靠特异性载体将物质逆浓度差转运至细胞内，但物质在运输的同时受到化学修饰（如发生磷酸化），因此使细胞内被修饰的物质浓度大大高于细胞外的浓度。此过程需要特异性的载体蛋白和能量的参与。

二、细菌的生长繁殖

（一）细菌生长繁殖条件

1.充足的营养

必须有充足的营养物质才能为细菌的新陈代谢及生长繁殖提供必需的原料和足够的能量。营养物质包括水、含碳化合物、含氮化合物、无机盐类和生长因子。不同细菌对营养物质的要求不同，在人工培养时必须按照要求满足其营养。

2.适宜的温度

细菌只能在一定温度范围内进行生命活动，温度过高或过低，细菌生命活动受阻乃至停止。各类细菌对温度的要求不同，可分为：嗜冷菌，最适生长温度10～20 ℃；嗜温菌，最适生长温度20～40 ℃；嗜热菌，最适生长温度56～60 ℃。病原菌均为嗜温菌，最适生长温度为37 ℃，故实验室一般采用37 ℃培养细菌。有些嗜温菌低温下也可生长繁殖，如5 ℃冰箱内，金黄色葡萄球菌缓慢生长释放毒素，故食用过夜冰箱冷存食物，可致食物中毒。

3.合适的酸碱度

在细菌的新陈代谢过程中，酶的活性在一定的pH 值范围才能发挥。多数病原菌最适pH 值为中性或弱碱性（pH 值7.2～7.6）。人类和动物的血液、组织液pH 值为7.4，细菌极易生存。胃液偏酸，绝大多数细菌可被杀死。细菌代谢过程中分解糖产酸，pH 值下降，影响细菌生长，所以培养基中应加入缓冲剂，保持pH 值稳定。

4.渗透压

细菌细胞需要在适宜的渗透压下才能生长繁殖。盐腌、糖渍具有防腐作用，即因一般细菌和霉菌在高渗条件下不能生长繁殖。不过细菌较其他生物细胞对渗透压有较大的适应能力，特别是有一些细菌能在较高的食盐浓度下生长。

5.必要的气体环境

氧的存在与否和生长有关，有些细菌仅能在有氧条件下生长，有的只能在无氧环境下生长，而大多数病原菌在有氧及无氧的条件下均能生存。一般细菌代谢中都需CO2，但大多数细菌自身代谢所产生的CO2 即可满足需要。有些细菌（如脑膜炎双球菌），在初次分离时需要较高浓度的CO2（5%～10%），否则生长很差，甚至不能生长。

（二）细菌生长繁殖的方式与速度

细菌以简单的二分裂方式无性繁殖，其突出的特点为繁殖速度极快。细菌分裂倍增的必需时间称为代时，细菌的代时取决于细菌的种类，又受环境条件的影响，细菌代时一般为20～30 min。个别菌较慢，如结核杆菌代时为18～20 h，梅毒螺旋体为33 h。

1.细菌个体的生长繁殖

细菌一般以简单的二分裂法进行无性繁殖，个别细菌（如结核杆菌）偶有分枝繁殖的方式。球菌可从不同平面分裂，分裂后形成不同方式排列。杆菌则沿横轴分裂。

2.细菌群体生长繁殖规律

在适宜条件下，多数细菌繁殖速度极快，分裂一次需时仅20～30 min。大肠杆菌的代时为20 min，在最佳条件下8 h 后，1 个细胞可繁殖到200 万以上，10 h 后可超过10 亿，24 h 后细菌繁殖的数量大到难以计数。但实际上，由于细菌繁殖中营养物质的消耗，毒性产物的积聚及环境pH 值的改变，细菌绝不可能始终保持原速度无限增殖，经过一定时间后，细菌活跃增殖的速度逐渐减慢，死亡细菌逐增、活菌率逐减。

将一定数的细菌接种适当培养基后，研究细菌生长过程的规律，以培养时间为横坐标，培养物中活菌数的对数以纵坐标，可得出一条生长曲线（图1.13）。

细菌群体的生长繁殖可分为以下4 期：

（1）迟缓期。是细菌在新的培养基中的一段适应过程。在这个时期，细菌数目基本不增加，但体积增大，代谢活跃，菌体产生足够量的酶、辅酶以及一些必要的中间产物。当这些物质达到一定程度时，少数细菌开始分裂，此期细菌的数量几乎不增加。以大肠杆菌为例，这一时期为2～6 h。

（2）对数期。又称指数期。细菌以最快的速度进行增殖，细菌数的对数与时间呈直线关系。一般地，此期的病原菌致病力最强，菌体的形态、大小及生理活性均较典型，对抗菌药物也最敏感。以大肠杆菌为例，这一时期为6～10 h。

（3）稳定期。该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、H2O2 等）积累、pH 值下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡，进入稳定期以大肠杆菌为例，这一时期约为8 h。

（4）衰亡期。随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数量明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辨认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。

体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现像培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。

三、细菌的新陈代谢

（一）细菌的酶

细菌新陈代谢过程的各种复杂的生化反应，都需要酶来催化。酶是活细胞产生的功能蛋白质，具有高度特异性。细菌的种类不同，细胞内的酶系统就不同，因而其代谢过程及代谢产物也往往不同。

细菌的酶有的仅存在于细胞内部发挥作用，称为胞内酶，包括一系列的呼吸酶以及与蛋白质、多糖等代谢有关的酶。有的酶由细菌产生后分泌到细胞外，称为胞外酶，胞外酶能把大分子的营养物质水解成小分子的物质，便于细菌吸收，包括各种蛋白酶、脂肪酶、糖酶等水解酶。根据酶产生的条件，细菌的酶还分固有酶和诱导酶：细菌必须有的酶为固有酶，如某些脱氢酶等；细菌为适应环境而产生的酶为诱导酶，如大肠杆菌的半乳糖酶，只有乳糖存在时才产生，当诱导物质消失，酶也不再产生。有些细菌产生的酶与该菌的毒力有关，如透明质酸酶、溶纤维蛋白酶、血浆凝固酶等。

（二）细菌的呼吸类型

根据细菌呼吸时对氧的需要程度，可将细菌分为需氧菌、厌氧菌、微嗜氧菌、兼性厌氧菌。

1.需氧菌

细菌只具有催化有氧呼吸的酶系统，必须在有氧的条件下才能够完成生长和繁殖，称为需氧菌，如绿脓杆菌。

2.厌氧菌

细菌只能在无氧条件下才能生长繁殖，称为厌氧菌，如破伤风梭菌、肉毒梭菌等。

3.微嗜氧菌

细菌酶介于需氧与厌氧之间，其代谢过程中虽然需要氧，但只在一定的压强下生长最好，如牛流产布鲁氏菌。

4.兼性厌氧菌

细菌的酶系统较完善，既含有催化有氧呼吸的酶，又含有催化无氧呼吸的酶，在无氧和有氧的条件下均能生长繁殖，如大肠杆菌。

（三）细菌的代谢产物

细菌在分解和合成代谢中能产生多种代谢产物，在细菌的鉴定及生化反应中有实际意义。

1.分解代谢产物

细菌的分解代谢产物，因各种细菌具备的酶不完全相同而有所差异。各代谢产物可通过生化试验的方法检测，通常称为细菌的生化反应或生化试验。

（1）糖的分解产物。不同种类的细菌以不同的途径分解糖类，其代谢过程中均可产生丙酮酸。丙酮酸进一步生成气体（CO2、H2 等）、酸类、醇类和酮类等。不同的细菌有不同的酶，对糖的分解能力也不同，有的不分解，有的分解产酸，有的分解产酸产气。利用糖的分解产物对细菌进行鉴定的生化试验有糖发酵试验、二乙酰试验（VP 试验）、甲基红（MR）试验、枸橼酸盐利用试验等。

（2）蛋白质的分解产物。细菌种类不同，分解蛋白质、氨基酸的种类和能力也不同，因此能产生许多中间产物。硫化氢是细菌分解含硫氨基酸的产物；吲哚（靛基质）是细菌分解色氨酸的产物；明胶是一种凝胶蛋白，有的细菌有明胶酶，使凝胶状的明胶液化；在分解蛋白质的过程中，有的能形成尿素酶，分解尿素形成氨；此外，有的细菌能将硝酸盐还原为亚硝酸盐等。利用蛋白质的分解产物设计的鉴定细菌的生化试验有吲哚试验、硫化氢试验、尿素分解试验、明胶液化试验等。

2.合成代谢产物

细菌通过新陈代谢不断合成菌体成分，此外，细菌还能合成很多在医学上具有重要意义的代谢产物。

（1）热原质。热原质即菌体中的脂多糖，大多是革兰氏阴性菌产生的。注入人或动物体内能引起发热反应，故名热原质。热原质耐高温，不被高压蒸汽灭菌法破坏，在制造注射剂和生物制品时，应注意将其除去。

（2）毒素。细菌产生的毒素有内毒素和外毒素两种。毒素与细菌的毒力有关。内毒素即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A，菌体死亡崩解后释放出来。外毒素是由革兰氏阳性菌及少数革兰氏阴性菌在生长代谢过程中释放至菌体外的蛋白质。具有抗原性强、毒性强、作用特异性强的突出特点。

（3）酶类。细菌代谢过程中产生的酶类，除满足自身代谢需要外，还能产生具有侵袭力的酶，这些酶与细菌的毒力有关，如透明质酸酶。

（4）色素。有些细菌能产生色素，对细菌的鉴别有一定意义。细菌色素有两类：水溶性色素，能弥散至培养基或周围组织，如绿脓杆菌产生的绿脓色素使培养基或浓汁呈绿色；脂溶性色素，不溶于水，仅保持在菌落内使之呈色而培养基颜色不变，如金黄色葡萄球菌色素。

（5）抗生素。某些微生物代谢过程中可产生一种能抑制或杀死某些其他微生物或癌细胞的物质，称抗生素。抗生素多由放线菌和真菌产生，细菌仅产生少数几种，如多黏菌素、杆菌肽等。

（6）细菌素。某些细菌能产生一种仅作用于有近缘关系的细菌的抗菌物质，称细菌素。细菌素为蛋白类物质，抗菌范围很窄，但可用于细菌分型和流行病学调查。细菌素以生产菌而命名。大肠杆菌产生的细菌素称大肠菌素，绿脓杆菌产生的称绿脓菌素，葡萄球菌产生的称葡萄球菌素。

（7）维生素。某些细菌能自行合成一些维生素，畜禽体内的正常菌群能合成维生素B和维生素K。

四、细菌的人工培养

用人工的方法，提供细菌生长繁殖所需要的各种条件，可进行细菌的人工培养，从而进行细菌的鉴定和进一步的利用。细菌的人工培养技术是微生物学研究和应用的重要手段。

（一）培养基的概念

把细菌生长所需的营养物质调配在一起制成的用于培养细菌的人工营养基质称为培养基。培养基的主要用途是促进细菌的生长繁殖，可用于细菌的分离、纯化、鉴定、保存以及细菌制品的制造等。

（二）常用培养基的类型

1.按物理性状分类

（1）液体培养基。将细菌生长繁殖所需的各种营养物质直接溶解于水，不加凝固剂制成的培养基为液体状态，即为液体培养基。液体培养基中营养物质以溶质状态存在其中，利于细菌充分接触和利用，从而使细菌更好地生长繁殖，故常用于生产和实验室中细菌的扩增培养。实际操作中，在使用液体培养基培养细菌时进行振荡或搅拌，可增加培养基中的通气量，并使营养物质更加均匀，可大大提高培养效率。如肉汤培养基。

（2）固体培养基。在液体培养基中加入2%～3%的琼脂而制成的培养基。固体培养基可根据需要制成平板培养基、斜面培养基和高层培养基等。平板培养基常用于细菌的分离、菌落特征观察、药敏试验以及活菌计数等；斜面培养基常用于菌种保存；高层培养基多用于细菌的某些生化试验。如琼脂斜面培养基、琼脂平板培养基。

（3）半固体培养基。在液体培养基中加入0.3%～0.5%的琼脂制成，凝固后培养基呈半固体状态。多用于细菌运动性观察，即细菌的动力试验，也用于菌种的保存。

2.按用途分类

（1）基础培养基。基础培养基是含有细菌生长繁殖所需要的最基本的营养成分，可供大多数细菌人工培养用。大多数细菌生长共同需要的营养成分，包括牛肉浸膏、1%蛋白胨、0.5% NaCl 等，pH 值7.2～7.6。如肉汤培养基、普通琼脂培养基。

（2）营养培养基。在基础培养基中添加血液、血清、葡萄糖、生长因子等，适合于营养要求较高的细菌。如血液琼脂平板（链球菌、肺炎球菌在其上才能生长良好）、鲜血琼脂培养基等。

（3）鉴别培养基。利用细菌对糖、蛋白质的能力与其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的指示剂，用于鉴别细菌。如糖发酵管、硫化氢、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、三糖铁琼脂培养基等。

（4）选择培养基。在培养基中加入某些化学物质，以抑制某些细菌生长而促进另一些致病菌的生长，达到选择分离的目的。如SS 琼脂培养基分离肠道细菌。

（5）厌氧培养基。专性厌氧菌不能在有氧环境中生长，将培养基与空气及氧隔绝或降低培养基中的氧化还原电势，可供厌氧菌生长。如肝片肉汤培养基、庖肉培养基，应用时于液体表面加盖液体石蜡以隔绝空气。

（三）制备培养基的基本要求

细菌的种类繁多，所需培养基的种类也很多，但制备各种培养基的基本要求是一致的，具体如下：

（1）选择所需的营养物质。制备的培养基应含有细菌生长繁殖所需的各种营养物质。

（2）调整pH 值。培养基的pH 值应在细菌生长繁殖所需的范围内。

（3）不含抑菌物质。制备培养基所用容器不应含有抑菌和杀菌物质，所用容器应洁净，无洗涤剂残留，最好不用铁制或铜制容器；所用的水应该是蒸馏水或去离子水。

（4）培养基应均匀透明。均质透明的培养基便于观察细菌生长性状及生命活动所产生的变化。

（5）灭菌处理。培养基及盛培养基的玻璃器皿必须彻底灭菌，避免杂菌污染，以获得纯目标菌。

（四）制备培养基的基本程序

配料→溶化→测定及矫正pH 值→过滤→分装→灭菌→无菌检验→备用。

（五）细菌在培养基上的生长特征

1.菌落特征

将单个微生物细胞接种在固体培养基的表面（有时为内部），当它占有一定的发展空间并处于适宜的培养条件时，该细胞就迅速生长繁殖。结果会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见，并有一定形态、构造的子细胞集团，这就是菌落。如果菌落是由一个单细胞发展而来的，则为纯种细胞群或克隆。如果将某一纯种的大量细胞密集地接种到固体培养基表面，长成的各“菌落”相互连接成一片，这就是菌苔。

描述菌落特征时须选择稀疏、孤立的菌落，其项目包括大小、形状、边缘情况、隆起形状、表面状态、质地、颜色和透明度等（图1.14）。多数细菌菌落圆形，小而薄，表面光滑、湿润、较黏稠，半透明，颜色多样，色泽一致，质地均匀，易挑取，常有臭味。这些特征可与其他微生物菌落相区别。

不同细菌的菌落也具有自己的特有特征，对于产鞭毛、荚膜和芽孢的种类尤为明显。例如，对无鞭毛、不能运动的细菌尤其是各种球菌来说，随着菌落中个体数目的剧增，只能依靠“硬挤”的方式来扩大菌落的体积和面积，因而就形成了较小、较厚及边缘极其圆整的菌落。对长有鞭毛的细菌来说，其菌落就有大而扁平、形态不规则和边缘多缺刻的特征，运动能力强的细菌还会出现树根状甚至能移动的菌落。有荚膜的细菌，其菌落往往十分光滑，并呈透明的蛋清状，形状较大。凡产芽孢的细菌，因其芽孢引起的折光率变化而使菌落的外形变得很不透明或有“干燥”之感，并因其细胞分裂后常成链状而引起菌落表面粗糙、有褶皱感，再加上它们一般都有周生鞭毛，因此产生了既粗糙、多褶、不透明，又有外形及边缘不规则特征的独特菌落。

同一种细菌在不同条件下形成的菌落特征会有差别，但在相同的培养条件下形成的菌落特征是一致的。所以，菌落的形态特征对菌种的分类鉴定有重要的意义。菌落还常用于微生物的分离、纯化、鉴定、计数及选种与育种等工作。

2.其他培养特征

培养特征除了菌落外，还包括普通斜面划线培养特征、半固体琼脂穿刺培养特征、明胶穿刺培养特征及液体培养特征等。

（1）普通斜面划线培养特征。在琼脂斜面中央划直线接种细菌，一般要培养1～5 天，观察细菌生长的程度、形态、表面状况等（图1.15）。若菌落与菌苔特征发生异样情况，表明该菌种受杂菌污染或发生变异，应分离纯化。

（2）半固体琼脂穿刺培养特征。在半固体培养基中穿刺接种，培养后观察细菌沿穿刺接种部位的生长状况等方面（图1.16）。例如，不运动细菌只沿穿刺部位生长，能运动的细菌则向穿刺线四周扩散生长。各种细菌的运动扩散形状是不同的。

（3）明胶穿刺培养特征。在明胶培养基中穿刺接种，经培养后观察明胶能否水解及水解后的状况（图1.17）。凡能产生溶解区的，表明该菌能形成明胶水解酶（即蛋白酶）。溶解区的形状也因菌种不同而异。

（4）液体培养特征。将细菌接种于液体培养基中，培养1～3 天，观察液面生长状况（如膜和环等）、混浊程度、沉淀情况、有无气泡和颜色等（图1.18）。多数细菌表现为混浊，部分表现为沉淀，一些好氧性细菌则在液面大量生长形成菌膜或菌环等现象。