4.2.4 色谱法
色谱法（chromatography），过去称色层法或层析法，它具有许多优点：选择性高，分离效果好，特别是对相似元素的分离可取得满意的分离效果；回收率高，这对浓集和提取微量元素具有特别重要的意义；可以分离无载体的放射性核素；设备简单，操作方便，便于远距离操作和防护。但是该方法也存在一些缺点：流速较慢，分离时间较长；固定相交换容量较小；有些固定相的热稳定性和辐照稳定性较差。这也使其应用受到了一定的限制。
4.2.4.1 色谱法的基本原理和分类
（1）基本原理
色谱法是利用混合物中各组分在固定相和流动相中亲和力的差异使各组分在两相之间分配不同来实现彼此分离的。当流动相连续流经固定相时，各组分在两相间进行反复多次分配，从而使亲和力差别即使很微小的各组分也能达到充分的分离。
（2）色谱法的分类
所有色谱系统都包括两个相，即固定相和流动相。按流动相物态的不同，色谱法可分为气相色谱法和液相色谱法；按固定相使用方式的不同，可分为柱色谱法、纸色谱法和薄层色谱法等；按分离过程原理的不同，可分为吸附色谱法、离子交换色谱法、萃取色谱法和凝胶色谱法等。
4.2.4.2 柱色谱法
柱色谱法按分离原理不同，可分为离子交换柱色谱法、吸附柱色谱法、萃取柱色谱法和凝胶渗透柱色谱法等，柱中的固定相分别为吸附剂、离子交换剂、色谱粉和凝胶等。
（1）离子交换柱色谱法
离子交换柱色谱法是利用某些固体物质中的可交换离子与溶液中的不同离子之间能发生交换反应来进行分离的一种方法。具有交换离子能力的固体物质称为离子交换剂，也就是固定相。
①离子交换剂的选择。
离子交换剂种类很多，大致可分为无机离子交换剂和有机离子交换剂，它们又各自有天然和人工合成两种。人工合成的无机阳离子交换剂——磷钼酸铵（AMP）常常用于铯的分离。当然，目前应用最广泛的是人工合成有机离子交换剂，即离子交换树脂，它是多孔性高分子聚合物，按可交换离子功能团类型的不同又可分为如下三大类：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和特种离子交换树脂。阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种，阴离子交换树脂分为强碱性和弱碱性两种。选择强酸（碱）性或弱酸（碱）性树脂，主要考虑因素是离子的电荷及其交换亲和力。影响离子交换亲和力大小的因素很多，主要是离子的电荷数Z和离子的水合离子半径（r水）。在常温和低浓度（＜0.1 mol/L）条件下，离子交换亲和力随着离子的电荷数增大或水合离子半径（r水）减小而增大。树脂粒度大小对分离效果和分离速度均有影响。一般说来，树脂粒度小，则离子交换速度快，柱效率高，分离效果好；但如果树脂粒度太小，则对流体的阻力过大，难以用于常压操作。一般情况下，选用60～120目的树脂粒度为宜。
②离子交换树脂的预处理。
市售树脂的预处理包括筛分、用去离子水浸泡、漂洗，然后按酸、水、碱（对阴离子交换树脂）或碱、水、酸（对阳离子交换树脂）的程序进行浸泡和洗涤，最后用水洗至中性备用。
③装柱与转型。
装柱的方法可分为干法和湿法两种：干法是直接将离子交换树脂慢慢加入柱中，使之填实，再用适宜的溶剂洗涤，并将柱中气泡全部除尽；湿法是先在柱内装入一定体积的水，再打开下部活塞，同时把预处理过的树脂和水混匀注入柱内，让树脂自由沉降，直至达到所需高度为止。此法填充均匀，气泡少，因此一般装柱常采用湿法装柱。转型即根据分离要求的不同，将树脂中的可交换离子转换成所需的形式。阳离子交换树脂可转成H+、NH+4、Na+和Cu2+型等，阴离子交换树脂可转成OH-、NO-3、Cl-和SO2-4型等。
④分离操作。
离子交换柱色谱法的分离操作一般有以下几个步骤：吸附、洗涤、淋洗和树脂再生。首先将待分离的物质配制成合适体系，以适当的流速上柱吸附，然后用洗涤剂洗涤未被吸附的物质。分离操作的关键是选择合适的淋洗剂，把吸附的不同欲分离的离子分别解吸下来。淋洗剂的选择主要是确定淋洗剂的种类、浓度和酸度。常用的淋洗剂为各种无机酸、碱、盐类化合物的水溶液及有机络合剂如羟基酸络合剂（枸橼酸、乳酸及α-羟基异丁酸等）和氨羧络合剂（EDTA、DTPA等）。此外，上柱吸附、洗涤和淋洗流速也是影响分离效果的重要因素。离子交换树脂在再生后可反复多次使用，每次分离后用淋洗剂继续淋洗一段时间，把吸附的物质给淋洗下来，然后用去离子水洗至中性待用。
⑤离子交换法的应用。
环境中90 Sr的分析就可采用离子交换法来进行锶和钙的分离，此法利用钙和锶与EDTA、H 3 Cit形成的络合物与强酸性离子交换树脂的亲和力不同而实现锶与钙的分离。调节溶液p H至4.0～5.0，溶液通过阳离子交换柱时，大部分钙能通过，而锶和部分钙被树脂所吸附，再用不同浓度和p H的EDTA-NH 4 Ac溶液先后淋洗出钙和锶。锶的淋洗液经过处理后，可进行90 Sr测量。
（2）吸附柱色谱法
吸附柱色谱法又可分为液-固和气-固两种，这里介绍液-固色谱法。
①基本原理。
吸附柱色谱法是利用溶液（流动相）在通过装有吸附剂（固定相）的柱子时，各组分吸附能力不同，在吸附剂上滞留程度也不同，从而实现各组分的分离的。
②基本操作。
吸附柱色谱法的基本操作主要有以下几个步骤。
a.吸附剂的选择和预处理。可选用的吸附剂很多，其吸附性能和应用范围各不相同。常用于放射化学分离的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭和分子筛等，可针对被分离物质的特性及分离要求来进行选择。应注意吸附剂本身的物理化学性质，以防吸附剂发生溶解或与吸附质及其介质等发生化学反应。例如，氧化铝就有酸性（p H为3.5～4.5）、中性（p H为6.9～7.1）和碱性（p H为10～10.5）三种，选用时要注意与吸附质及其料液的酸碱性相适应。又如，用于99 Mo-99 m Tc发生器的吸附剂就是酸性氧化铝。吸附剂的表面性质（如比表面及活性等）与吸附剂的原料、制备工艺、粒度和含水量等因素有关。通常应选用粒度较小且均匀、比表面大、活性强的吸附剂，还要注意吸附剂表面的极性。一般带电离子和极性分子的分离宜选用极性吸附剂。吸附剂选定后，需要进行预处理，包括用水和酸浸泡、洗涤及活化处理等。例如，氧化铝的预处理是将市售的氧化铝经粉碎、过筛后，用水和酸浸泡、洗涤，在500～600℃下烘烤4 h，然后在真空干燥器中冷却，即得到活性氧化铝。
b.装柱。装柱的方法有湿法和干法两种，具体操作与离子交换柱色谱法相同。
c.分离操作。常用的分离方法为淋洗法，即先将含有欲分离物质的料液吸附在色谱玻璃柱上，形成初始谱带，然后用适宜的淋洗剂解吸，使各组分的谱带距离拉大，最后彼此分开。淋洗剂应选择与欲分离物质有较高亲和力而与其他杂质亲和力小的溶液。淋洗的速度不可太快，否则组分之间难以充分分离，淋洗体积应很大；淋洗的速度也不宜太慢，太慢会发生纵向扩散，同样不利于分离。
（3）萃取柱色谱法
萃取柱色谱法可分为正相萃取柱色谱法和反相萃取柱色谱法两种。正相萃取柱色谱法中水溶液被吸附在吸附剂上作为固定相，有机萃取剂为流动相。此法的缺点是对无机物的分离效果差、有机萃取剂用量大、操作繁杂等，因此，此法一般只适用于微量有机物的分离。反相萃取柱色谱法是使有机萃取剂吸附在支持体上作为固定相，水溶液为流动相，由于它把溶剂萃取法和色谱法结合起来了，如同多级逆流萃取器一样，水相中欲分离物质在色谱柱中可进行多次分配，因而具有很高的分离效率，适于从水溶液中分离复杂的微量无机物。而且，由于固定相可反复使用，这就大大节省了有机萃取剂的用量。现在，人们习惯上只把反相萃取色谱法称作萃取色谱法。该方法的缺点是：与萃取法和离子交换柱色谱法比较，其交换容量小，只适于微量物质的分离；固定相会流失，致使柱容量逐渐下降，影响柱的稳定性和分离效果。
①基本原理。
萃取柱色谱法是利用不同物质在固定相（萃取剂）和流动相（试样、淋洗剂）之间萃取分配系数的不同来达到彼此分离的。例如，试样中含有A和B两种物质，分配系数D A＜D B，则当试样流经萃取色谱柱时，因为A不容易被萃取，它下移的速度就比B快，形成上部为B、下部为A的谱带，然后用适当的淋洗剂进行淋洗，就能从流出液中分别收集到A和B两种物质。
②支持体与固定相。
在萃取柱色谱法中，将有机萃取剂吸附在惰性固体物质的表面，然后装入柱中。这种起着支持萃取剂作用的惰性固体物质称为支持体，萃取剂称为固定相，吸附了萃取剂的支持体称为色谱粉。对支持体的要求是：多孔结构，孔径均匀，比表面积大，粒度适宜，能吸附足够量的固定相且结合牢固，还应具有较好的化学稳定性、热稳定性和机械强度等。目前常用的支持体有以下几类：①含硅无机化合物，如硅胶、硅藻土、玻璃粉等。这类支持体是亲水性的，因此在吸附萃取剂之前必须进行硅烷化处理。②含氟塑料，如聚四氟乙烯粉、聚三氟氯乙烯（Kel-F）粉等。③聚乙烯类高分子聚合物，如聚乙烯粉、苯乙烯-二乙烯苯共聚物等。(https://www.daowen.com)
对于作为固定相的萃取剂，主要要求是：对支持体具有较强的浸润能力，水溶性小，黏度小，对被分离物质的分配系数大，选择性好等。原则上，凡是用作溶剂萃取的萃取剂均可作固定相，其中应用最普遍的是中性磷类萃取剂（如TBP）、酸性磷类萃取剂（如HDEHP）和胺类萃取剂（如TOA）等。
目前，萃取柱色谱法中出现了一种把固定相和支持体聚合在一起的萃淋树脂。所谓萃淋树脂通常是指以苯乙烯-二乙烯苯为骨架，其中含有某种萃取剂的大孔树脂的总称。它兼有萃取剂和离子交换树脂的优点，克服了萃取柱色谱法中萃取剂含量小且易流失的缺点。已经应用的萃淋树脂有中性磷类萃淋树脂（如CL-TBP）、酸性磷类萃淋树脂（如CL-P204）、螯合类萃淋树脂（如CL-PMBP）、胺类萃淋树脂（如CL-7301）等。
③基本操作。
a.色谱柱的制备。
（a）调制色谱粉：选定支持体和固定相后，需要调制色谱粉。通常先用选定的稀释剂与萃取剂配制成有机溶剂，在不断搅拌下加到支持体中，使之充分混匀，然后置于红外灯下烘干即可。
（b）装柱：装柱的方法有湿法和干法两种，具体操作与离子交换柱色谱法相同。
b.分离操作。
萃取柱色谱法分离操作的主要步骤为料液上柱萃取、洗涤和淋洗，其具体操作与离子交换柱色谱法大致相同。需要指出的是，为了减少萃取柱色谱法中萃取剂的流失，延长色谱柱的使用寿命，洗涤和淋洗操作所用的水相要用相应的萃取剂进行预平衡处理。
c.条件选择。
影响萃取柱色谱法分离效果的因素很多，基本上与离子交换柱色谱法类似。下面仅就一些主要条件的选择作补充说明。
（a）支持体与固定相。首先，应根据分离物质和分离要求来选择支持体和固定相。选择支持体时，不仅要注意支持体的类型、粒度，还必须注意同一类型产品的规格。固定相的选择与溶剂萃取法萃取剂的选择基本相同。要强调的是，用作固定相的萃取剂对支持体的浸润性能要好，能牢固地被支持体吸附，不易流失。通常选用的固定相都是一些沸点、相对分子质量、黏度较高的有机萃取剂，先用合适的有机溶剂稀释，才能用于调制色谱粉。
（b）流动相。在萃取柱色谱法中，凡流经固定相的溶液，包括料液、洗涤剂、淋洗剂，统称为流动相。这些溶液的条件，如酸的种类、酸度、掩蔽剂和盐析剂的浓度等，与溶剂萃取法中的条件选择相似。
④应用。
萃取柱色谱法由于分离效率高，操作简便、快速，已成为分离微量放射性物质和相似元素的一种有效手段。例如，对稀土元素的分离，可将料液通过经硅烷化处理的硅胶作支持体、TBP作固定相的色谱柱，后用15.1 mol/L HNO 3作淋洗剂，即可把稀土元素逐个淋洗下来。
（4）凝胶渗透柱色谱法
凝胶渗透柱色谱法是利用交联、聚合而形成的表面惰性的多孔物质凝胶，经泡胀后具有一定孔径的三维网状结构，其网孔可使一定大小的分子渗透入内，较大的分子不能进入网孔，可不受阻滞地通过色谱柱，从而达到分离不同大小分子的目的。
凝胶渗透柱色谱法分离的关键是凝胶。常用的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）、琼脂糖（Sepharos和Bio-Glas）、二乙烯苯凝胶等。其中，葡聚糖凝胶是生物化学领域中应用最广的凝胶。它是先用细菌发酵将蔗糖合成相对分子质量为1×107～3×108的葡聚糖，再用稀盐酸分解成平均相对分子质量为4×104～20×104的葡聚糖，然后用环氧丙烷交联成型。选择适宜的条件，可控制交联度和网孔的大小。葡聚糖凝胶常用水溶胀，也可用乙二醇、二甲亚砜或甲酰胺溶胀，一般浸泡时间为6～24 h，用倾泻法漂去细微颗粒即可装柱使用。
凝胶渗透柱色谱法的优点是：不依赖流动相和固定相的相互作用，因此操作简单，无需梯度淋洗装置；试样在色谱柱中的保留时间比其他色谱法短得多，因而淋洗峰相对较窄，有利于检测；无须依赖固定相，因此分离容量比其他色谱法大得多，且回收率高，副反应少，凝胶使用寿命长。其缺点是：淋洗峰的容量小，不能分离分子大小相近的物质。
凝胶渗透柱色谱法的基本操作与离子交换柱色谱法大致相同，不再赘述。
（5）高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）是以液体为流动相、固态或液态物质为固定相的色谱方法。由于设备采用了具有高压泵（100～500 kg/cm2）、高流速[10～25 m L/（cm2·min）]、高效固定相和高灵敏度的检测器，从而具有分离速度快、效果好的特点。
高效液相色谱法一般采用不锈钢柱子，固体固定相的粒度小于20μm。由于操作压力高，因此对设备的要求也高。它需要特别的耐高压的色谱柱、泵、阀门和液槽等设备，以适应流速快、控制要求严的特点。
目前，许多生化物质的分离都用高效液相色谱，而且根据不同分离对象可更换适宜的色谱柱，灵活、方便，因而应用广泛。此外，HPLC配备不同的检测器，还可用于分析。例如，在放射性药物的研制中，HPLC连接放射性探测器，可用来进行标记物的放射性纯度测定。
4.2.4.3 纸色谱法
纸色谱法是用色谱纸或以萃取剂、液体离子交换剂吸附在色谱纸上作固定相，用有机溶剂或水溶液作流动相来分离不同物质的一种色谱分离方法。纸色谱法分离操作一般包括点样和展开两个步骤。纸色谱法分离示意图如图4.3所示。
图4.3 纸色谱法分离示意图
样品被点在原点，干后将色谱纸浸入展开剂中，原点离展开剂液面1 cm以上。在色谱纸的毛细作用下，展开剂带着样品中的不同组分以不同的速度向另一端移动。各组分在色谱纸上移动的情况可用比移值（R f）来表示：
A、B两组分的R f分别为a/c和b/c。R f相差越大，表示A、B两种组分越容易分离。
纸色谱法的测量可采用放射性扫描色谱仪进行测量，也可把色谱纸按一定间距剪下进行放射性测量。
4.2.4.4 薄层色谱法
薄层色谱法是将固定相均匀涂覆在一块玻璃板或塑料板上，形成薄层，然后将样品滴在薄层的一端（即原点），用适宜的展开剂作流动相，借助于毛细作用，使不同组分随流动相展开，以达到分离的目的。该方法结合了柱色谱法和纸色谱法的优点，但由于薄层制作的重现性较差，这限制了它的应用。
纸色谱法与薄层色谱法常常用于微量物质的分离和标记化合物的放射化学纯度的测定。这两种方法的具体分离操作步骤可参考有关专业书。