5.5.2 微核生物剂量测定
1973年，赫德尔（Heddle）推荐使用微核检测的方法来衡量染色体损伤，在辐射领域内得到了广泛的研究和应用。大量研究表明，在一定剂量范围内，离体和整体条件下微核率均呈明显的剂量-效应关系，并经放疗患者和动物实验证明，离体和整体照射微核效应一致，这表明淋巴细胞微核率可以作为估算受照剂量的生物学指标。随着研究的深入和技术手段的进步，1985年，费内克（Fenech）和莫利（Morley）改进了微核的实验方法，提出了胞质分裂阻滞微核法（cytokinesis-block method，CB微核法），使淋巴细胞微核在辐射生物剂量估算领域的运用更为广泛。2001年，国际原子能机构在技术报告丛书405号《辐射剂量估算的细胞遗传学方法》中增加了CB微核法内容。我国也在1999年发布了微核法的行业标准——《淋巴细胞微核估算受照剂量的方法》（WS/T 187—1999）。外周血淋巴细胞微核率测定作为对职业性放射性工作者所受辐射损伤的评价是一项非常有意义的指标，亦被列为我国慢性放射病诊断的重要检测指标之一。
5.5.2.1 微核
微核（micronucleus，Mn）也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，也是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。断裂残留的无着丝粒断片（染色体碎片）或在分裂后期落后的整条染色体，在分裂末期都不可能纳入主核。当进入下一次细胞周期的间期时，它们在细胞质内浓缩成小的核，称为微核。
微核的形态学特征是：
①存在于完整的胞浆中，小于主核的1/3；
②形态为圆形或椭圆形，边缘光滑；
③与主核有同样结构；
④嗜色性与主核一致或略浅，福尔根（Feulgen）染色阳性或有DNA的特异性反应；
⑤与非核物质颗粒相反，微核不折光；
⑥与主核完全分离，如相切，应见到各自的核膜。
辐射诱发的外周血淋巴细胞染色体畸变主要是染色体型畸变，其中非稳定性染色体畸变包括无着丝粒断片、微小体、无着丝粒环、双着丝粒体和着丝粒环。它们在有丝分裂过程中大部分不能被纳入新的细胞核中，而在间期形成微核，因此辐射诱发的外周血淋巴细胞微核与染色体畸变存在直接联系。
5.5.2.2 外周血淋巴细胞微核测定方法
外周血淋巴细胞微核法被广泛应用的同时，其也得到不断改进，从最早得到广泛应用的甲基纤维素法（直接法），发展到常规培养法、胞质分裂阻滞微核法。
（1）甲基纤维素法
甲基纤维素法的一般步骤为先在抗凝静脉血中加入0.5%甲基纤维素，37℃温浴30 min，再经离心、涂片、染色后进行微核显微观察计数。其特点是方法简单，制片迅速，缺点是因淋巴细胞未经培养，不能观察到分裂中期的非稳定性染色体畸变在下一分裂间期形成的微核。目前，甲基纤维素法已基本被常规培养法、胞质分裂阻滞微核法所替代。(https://www.daowen.com)
（2）常规培养法
常规培养法的一般步骤为先将抗凝静脉血在RPMI 1640完全培养基中37℃培养72 h，再经离心、低渗、预固定、固定、滴片、染色等过程后，进行微核显微观察计数，该法大大提高了淋巴细胞微核的检出率，方法较简便，经济，适合基层开展，是目前使用更广的淋巴细胞微核方法。
（3）胞质分裂阻滞微核法
淋巴细胞微核仅出现在诱发后经过一次分裂的间期细胞中，早先采用的甲基纤维素法和常规培养法由于均不能分辨出未转化的、分裂一次的和分裂一次以上的淋巴细胞，影响了微核分析的正确性，使这些技术的应用受到一定的限制。1985年，费内克等提出胞浆分裂阻滞微核法，该法先将抗凝静脉血在RPMI 1640完全培养基中37℃培养72 h，之后离心、低渗、预固定、固定、滴片、染色等过程同常规培养法，不同之处在于在培养进行至44 h时加入松胞素-B（cytochalasin-B，Cyt-B），它在不干扰细胞核分裂的同时阻滞胞浆的分裂。于是，分裂一次的所有淋巴细胞的胞浆中将出现两个细胞核，这种双核细胞称为胞质分裂阻滞细胞（cytokinesis-block cell，简称CB细胞）。CB细胞很大，具有双核，极易鉴别（图5.20）。如果第二次胞浆分裂被阻滞，则形成3核或4核细胞，故双核CB细胞是只经历一次分裂的细胞。计数CB细胞中的微核率，可显著提高微核检测的灵敏度和准确性。目前建立淋巴细胞微核的剂量-效应曲线均需要采用胞质分裂阻滞微核法（CB微核法），它的不足是松胞素B价格昂贵，基层不易开展。
图5.20 CB微核法的双核细胞和微核
5.5.2.3 淋巴细胞微核观察
（1）淋巴细胞微核的判断标准
微核直径为主核的1/20～1/3；微核染色性质与主核一致，染色可略淡；微核与主核在同一细胞中（CB微核法中微核应与两个主核在同一细胞中）；微核与主核不连接；微核不折光，易与染料颗粒、杂质相区别。
（2）淋巴细胞计数数目
样本计数细胞数直接影响微核率的准确性。计数细胞过少，虽观察速度快，但微核率结果误差太大；而计数细胞过多，则费时费力。目前，甲基纤维素法和常规培养法每个样本须计数2 000个淋巴细胞，CB微核法每个样本须计数1 000个双核CB细胞。
（3）淋巴细胞微核率
微核率的记录常同时使用细胞微核率（‰）和微核细胞率（‰）。细胞微核率表示1 000个细胞中所观察到的微核数目，因为一个细胞中可能观察到多个微核，细胞微核率（‰）可超过1 000‰；微核细胞率表示1 000细胞中观察到的含有微核的细胞数，微核细胞率（‰）不可能超过1 000‰。
（4）淋巴细胞微核的自发率
甲基纤维素法的微核自发率约为0.1‰～0.3‰，波动较大；常规培养法的微核自发率≤5‰；CB微核法的微核自发率约为10‰～20‰，自发率高于前两种方法的原因在于双核CB细胞是只经历一次分裂的细胞。计数CB细胞中的微核率，可显著提高微核检测的灵敏度和准确度，同时松胞素-B本身也具有一定毒性，会诱发一定数量微核。