5.5.5　体细胞基因突变分析

电离辐射诱导的造血细胞DNA损伤可导致体细胞中一些编码标志蛋白的基因位点突变，从而产生异常的编码蛋白或蛋白缺失，这些异常或缺失的蛋白可作为剂量监测的标识。常见的有HPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶）、GPA（血型糖蛋白A）、TCR（T细胞抗原受体）、HLA（人白细胞抗原）等。

5.5.5.1　次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HPRT）基因突变分析

HPRT基因是体细胞突变研究中常用的基因。人和啮齿类细胞的HPRT基因位于X染色体上。在雄性中，HPRT基因呈半合子状态；而在雌性中，由于该基因在一条X染色体上失活而呈效应性半合子状态。X染色体的失活发生在雌性发育的早期。随后体细胞中只有一个活性的HPRT基因，它的失活使细胞的表型为HPRT。人类HPRT基因位于X染色体（Xq27）上，基因序列长44 kb，带有9个外显子。该基因产物为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶，它是一种嘌呤合成酶，该酶由2～4个蛋白亚单位组成，_该酶促进次黄嘌呤鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸间的转磷酸核糖基作用而生成相应的核苷-5-单磷酸，这是细胞体内嘌呤核苷酸生物合成中的一条补救途径。该酶对于维持细胞内嘌呤核苷酸的含量，特别是合成新的核苷酸能力低下的细胞具有重要意义。

H_PRT特异性不强，在细胞DNA合成时可将嘌呤类似物6-巯基鸟嘌呤（6-TG_）和8氮杂鸟嘌呤（8-AG）掺入到DNA中，阻断半保留复制，形成一种致死性的核苷5磷酸盐，造成细胞死亡。细胞HPRT基因突变后，不能编码生成HPRT，使突变细胞对6-TG或8-AG产生抗性作用，嘌呤类似物就不能掺入到DNA中，不影响其复制。因此，在选择性培养基中，突变的细胞能存活，正常细胞却因6-TG或8-AG的毒性作用不能分裂甚至发生死亡，因此通过检测分裂细胞的数目便能确定HPRT基因突变频率（mutation frequence，MF）。近年来，多种基因突变检测方法得到发展，可在细胞水平上测定基因突变，如放射自显影法、荧光显微镜法和多核细胞法等，也有在分子水平上以测定突变类型和比例的基因突变谱为主的细胞克隆法。

HPRT基因位点是一个对电离辐射和化学诱变剂都非常敏感的位点，在单基因突变研究中，该基因是一个经典的基因位点，其突变基因可在体内长期存在。有关电离辐射引起的HPRT基因位点突变与照射剂量间关系的基础性研究，文献报道较多。离体照射的研究表明，HPRT基因位点突变频率与照射剂量呈线性关系。关于原爆幸存者的研究，箱田（Hakoda）等用T淋巴细胞克隆法，分析了40年后30名原爆幸存者和17名对照者的HPRT基因突变频率，同时进行了染色体畸变分析。结果表明，两组间差异显著，P＜0.05。作者认为，在照后40年，HPRT基因突变频率仍能反映受照剂量。基因突变频率与染色体畸变率的对比分析表明，两者间存在着线性关系，随染色体畸变率增加，HPRT基因突变频率也增加，其关系式为Y=（3.7±0.08）X（Y为HPRT基因突变频率，X为染色体畸变率，相关系数r=0.34）。在事故受照人员的生物剂量测定中，夏寿萱等对5例受60 Coγ射线意外照射的人员进行了HPRT基因突变谱的分析，在受照4.5年后外周血淋巴细胞HPRT基因缺失总数与受照剂量有依赖关系。在职业性放射工作者的生物剂量测定中，史纪兰等用多核细胞法检测30例X射线工作者淋巴细胞HPRT基因突变频率，根据剂量-效应曲线估算了受照的累积剂量和年剂量当量，对工龄与突变率的关系进行了分析。由此可见，HPRT基因位点突变分析可用于急性和慢性小剂量照射。其不足之处是：HPRT基因突变的特异性不强，自发率较高，并且随年龄增长，自发突变率也有所增高。(https://www.daowen.com)

5.5.5.2　血型糖蛋白A（glycophorin A，GPA）基因位点突变分析

GPA是分布于人类红细胞（red blood cell，RBC）表面的一种重要的血型糖蛋白，由一条含131个氨基酸残基的肽链和一条含16个糖基的糖链构成。在每个RBC表面约有5×105个GPA分子，GPA分子有M、N两种形式，并以此决定了人类的MN血型系统，人群中共有MM、MN和NN 3种血型表现。编码GPA-M、GPA-N分子的等位基因位于4q28-31，为共显性表达，在人群中的频率基本相当，所以人群中约一半人为MN杂合子个体。

GPA突变分析技术仅适于测定人群中MN杂合个体的基因突变频率。理论上讲，MN个体外周血RBC中存在4种GPA变异体细胞（variant cell，VC）：单倍型MΦ、NΦ和纯合型MM、NN。当用不同颜色荧光标记的GPA-M或GPA-N的单克隆抗体（Mc Ab）与RBC结合时，由于正常RBC（MN）与VC表面GPA分子抗原分布的种类或数量不同，而结合不同的Mc Ab，使荧光颜色或强度不同，经流式细胞仪测定时，根据荧光信号的差异将VC记录下来。外周血RBC无核，缺乏自我增殖能力，GPA分析系统所检测到的突变实际上是来自骨髓干细胞或RBC成熟过程中GPA表达前的RBC前体细胞。如RBC前体细胞的GPA基因发生突变，经分裂发育成熟后，在外周血RBC中表现出来，但这些VC会在一个RBC生活周期（120 d）后消失；如突变发生在干细胞，骨髓干细胞就会累积这些突变，并在受照者的终身造血过程中，通过不断产生相应的VC而将GPA突变频率持久稳定地表现出来。

体细胞GPA基因对电离辐射和化学诱变剂都有非常敏感的位点，GPA基因突变分析反映的是骨髓干细胞的基因突变频率，该基因突变为中性突变，故其VC在体内长期存在。许多学者认为GPA突变分析有望作为个体终生生物剂量计，其在原爆幸存者及核事故受害者生物剂量测定中已得到成功应用。例如，秋山（Akiyama）等对703例原爆幸存者的GPA进行了研究，其中246例远距离受照者为对照组（估算剂量＜0.005 Gy），457例为实验组（估算剂量＞0.01 Gy）。结果表明，即使在原爆40多年后，幸存者的GPA突变频率仍明显高于对照组，并与估算的受照剂量间有显著的量效关系。简森（Jensen）等对13名切尔诺贝利核电站事故受害者进行GPA突变分析。结果表明，事故后3～4年，其GPA突变频率仍显著高于对照组，并与用双着丝粒体估算的受照剂量之间有明显的量效关系。由此可见，GPA基因位点突变分析了个体生存过程中所记录的累积生物效应，因此可作为终生的生物剂量计。GPA基因突变分析用流式细胞仪检测1×106个细胞只需几分钟，分析速度快，且稳定性好，重复性高，但FCM、荧光Mc Ab价格昂贵，且GPA突变频率的个体差异较大，仅能用于MN型个体。