5.5.4 荧光原位杂交技术分析
随分子生物学技术的迅猛发展，荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术被运用到染色体畸变分析及剂量的估算中，它是一种快速分析人类染色体结构畸变，特别是相互易位的新方法。基本原理是利用生物素（biotin）标记的已知碱基序列的核酸作为探针，按照碱基互补的原则，与标本上细胞染色体的同源序列核酸进行特异性结合，然后用荧光标记的生物素亲和蛋白（avidin）和抗亲和蛋白的抗体进行免疫检测和放大，使探针杂交区发出荧光，形成可检测的杂交双链核酸，最后在荧光显微镜下检查探针存在与否。结合了探针的染色体呈现出特定的颜色，未结合探针的染色体不着色，因而着色与未着色的染色体间发生了互换，这种异常的染色体在荧光显微镜下非常容易鉴别。目前，在辐射生物剂量学领域的FISH研究中，选用的探针主要是全染色体探针、泛着丝粒探针、特异性的端粒和着丝粒探针等。不同探针的组合，加上FISH技术正由单色、双色FISH向多色FISH（M-FISH）发展，这样就可获得更加生动的彩色染色体图像，不但能快速、正确检测双着丝粒体，而且能很容易地辨认出易位、缺失和插入。
辐射诱发的双着丝粒体和易位与照射剂量间呈良好的量效关系。急性照射的剂量估算主要分析双着丝粒体。双着丝粒体的检测，在FISH技术中可以用泛着丝粒探针进行杂交，杂交后使细胞中的染色体着丝粒区着色，在荧光显微镜下能快速计数双着丝粒体。易位在受照者体内不影响或不严重影响细胞的生存和繁殖，并且在体内能长期保持相当恒定，至少变化很少。虽然外周血T淋巴细胞具有不同的寿命，但由于骨髓造血干细胞不断补充，外周血淋巴细胞的易位率可保持稳定。有研究表明，易位畸变至少在10年内保持稳定，尤其是单纯的完全相互易位细胞在分裂时不会被淘汰，基本上不受时间长短的影响，特别适用于慢性照射和早先受照者的剂量估算。FISH技术通过特异性DNA探针，使特定的染色体着色，从而能迅速有效地检测与这些染色体相联系的染色体结构畸变，使易位染色体的分析大大简化。目前有两类探针成功地应用于易位的检测中。一类是采用染色体区域的重复序列，如染色体的着丝粒区和端粒区重复序列作探针。杂交后，染色体在上述两个区域内显示出两个杂交信号。如果该染色体发生相互易位，根据互换情况，这两个信号可分开，分别位于两个不同的染色体上。另一类探针是一条或数条全染色体探针，目前在辐射研究领域中用得较多的有1、2和4号全染色体探针（图5.21）。这类探针杂交后可以使同源的整条染色体着色，如果着色和未着色的染色体之间发生易位，则表现为染色体的一部分着色，另一部分不着色，很易鉴别。可见，用FISH技术可以大大提高易位的检出率。
图5.21 FISH进行染色体易位分析
目前，FISH技术已在生物剂量测定中进行了广泛的研究。剂量效应曲线的研究结果一致表明，随着照射剂量的增加，涉及探针的双着丝粒体和易位明显增加。按卢卡斯（Lucas）推荐的经验公式F P=2.05f P（1-f P）F G，式中，F P为全基因组易位率或双着丝粒率，f P为探针覆盖的基因组部分DNA含量，F G为FISH检测的易位率或双着丝粒率。由FISH方法观察到的双着丝粒率和易位率换算成全基因组的双着丝粒率和易位率均符合线性平方模式，即Y=a+bD+c D 2。
早先受照者的研究包括原爆幸存者、早先事故受照者和职业受照者三类。卢卡斯（Lucas）报道，用1、2和4号全染色体探针、着丝粒探针和G显带同时检测20例原爆幸存者的易位率。结果表明，随着剂量增加，两种方法间的线性回归斜率为0.75，相关系数为0.98，同时研究者还将离体的易位率剂量-效应曲线和原爆幸存者照后4.5年时检查的易位率剂量效应资料做了比较。总的来说，二者在形状和大小上很类似。在早先事故受照者的研究中，斯特劳默（Straume）等报道，巴西Goiamia 137 Cs源事故后，研究者立即用双着丝粒体对受照者进行了检测；在照后1～1.4年分别用1、2、4和1、3、4号两组全染色体组合探针对其中3人的易位率进行检测，并估算剂量，结果与事故后立即用双着丝粒体所估算的剂量比较接近。刘青杰等报道两例早先事故受照者，均为放射从业人员。案例1，X射线探伤工人，从事该工作8年，前7年无任何防护措施，曾受照1次，误照后3年取外周血样本。案例2，60 Co管理人员，曾在30年前因换源和处理事故受到3次意外照射。研究者用8对端粒和着丝粒特异性探针M-FISH方法，检测其完全相互易位率，参照标准剂量-效应曲线，估算他们的累积受照剂量。结果显示，早先事故受照者的双着丝粒体很少。易位估算的剂量，案例1为81.3 cGy，案例2为155.7 cGy。研究者认为该法有望用于早先事故受照者的剂量重建。
关于职业受照者，李进等报道用FISH（4、7号全染色体探针）和G显带法对医用诊断X射线工作者的剂量进行重建。对照组37人，其中24人用G显带法，13人用FISH法。职业受照组124人，其中96人进行G显带分析，28人进行FISH分析。结果表明，G显带和FISH法检测的易位率随工作年限的增加而增大，用易位率估算的生物剂量也随年限增加而增大，且两种方法估算的生物剂量基本一致，与物理方法估算的剂量也很接近。这表明两种方法均可推测原先受照者的累积剂量，也可用作职业性受照人员的剂量重建工作。
用FISH方法可以大大提高易位的检出率，与G显带技术相比，节省了人力物力。由于不需要分散良好的中期分裂相作分析用，FISH增加了可供分析的细胞数，提高了检测的精确度。可见它是一种快速、准确的很有前途的生物剂量测定方法，是当前辐射细胞遗传学发展中的一门前沿技术。其不足之处是：对某些稳定性染色体畸变，如倒位和缺失不甚敏感；由于探针的特异性，只有某些与探针相对应的染色体畸变才能被察觉；该技术要求高，且需要高纯度试剂，价格昂贵。故其生物剂量测定还有不少问题需要进一步的深入研究，如用FISH方法观察到的染色体易位率换算成全基因组染色体易位率是否符合卢卡斯推荐的经验公式，以及用易位率进行回顾性剂量重建时，易位不随时间延长而降低的假设是否成立等都有待深入探讨。