5.5.6 DNA损伤和突变分析
电离辐射可诱导DNA多种形式的损伤和突变。这些损伤和突变可以来自细胞核，也可以来自线粒体DNA。随着分析技术的发展，研究人员正利用各种手段寻找具有良好剂量响应的DNA损伤指标作为生物剂量标志物。然而，这些新方法和指标在获得认可之前，尚有许多工作要做，需要接受更多实际应用的检验。
5.5.6.1 细胞凝胶电泳或彗星电泳分析
单细胞凝胶电泳法（single cell gel electrophoresis assay，SCGE）又称彗星试验（comet assay），近几年在DNA损伤和突变分析方面得到了广泛的应用。SCGE敏感、快速、简便、重复性好，无须放射性示踪，并且可以直接观察单个细胞DNA损伤，在检测诱变剂、射线等对DNA损伤、监测环境污染物对机体的遗传损伤、研究毒物致癌机制等方面有着广泛的应用价值，从而成为近年来发展起来并流行的DNA损伤检测的新技术。
这种技术可在单细胞水平定性定量测定DNA损伤，尤其是DNA链的断裂。方法：先将一定数量的照射细胞与0.75%的低熔点胶在37℃均匀混合备用，取一载玻片均匀铺上0.1%的凝胶，将制备好的细胞-低熔点胶悬液铺在凝胶上，置载玻片于冰上约5 min，然后浸在新鲜配制的冷的细胞裂解液中去除核膜和蛋白质，接着将载玻片浸于中性（p H=7～8，主要测双链断裂和交联）或碱性（p H=12～13，主要测单链断裂、切除修复位点、碱性易变位点和交联）缓冲液中使DNA解旋；置载玻片于电泳槽电泳。在电场的作用下，断裂的DNA链、碱性易变位点、不完全的DNA切除位点以较快速度迁移，而DNA-DNA交联或DNA-蛋白交联的迁移速度较慢，形成一个头尾分明的彗星样电泳图案（图5.22）。电泳分离后载玻片经染色可在荧光显微镜下观察或进行图像扫描，由特别设计的计算机软件对图像进行分析和计算。可通过计算损伤细胞的百分率、分类DNA损伤的形式、电泳图像彗星尾的长度和彗星图像长度与彗星头的宽度比来评价DNA的损伤，建立量效关系。通常，尾巴长度代表最小可测DNA，迁移DNA的百分数代表迁移DNA的量，迁移DNA量×尾巴长度代表尾巴的力矩。此方法的优点是细胞用量少，灵敏度高（可测5 cGy的γ射线），可分析任何真核细胞，经济、快速、简单。缺点是方法的敏感性太高，区分DNA损伤类型的特异性较差。该方法需要设置专门的分析计算软件对结果进行分析。此外，在进行DNA链断裂分析时，由于DNA损伤的同时伴随着重接修复，故此分析要求照射后立即采样进行分析，否则离照后时间越长，分析结果的误差越大。
5.5.6.2 DNA损伤的免疫荧光测定
这种技术利用荧光标记的抗单链DNA断裂和碱基损伤的抗体与DNA断裂部位或受损碱基的特异结合，通过测定荧光强度确定DNA链断裂或碱基损伤的量与照射剂量间的关系。范德安斯（Vander Schans）等用夹心酶联免疫吸附方法测定DNA单链断裂和碱基损伤的量来确定照射剂量。此方法对DNA单链断裂可测出的照射剂量范围为0.2～10 Gy，考虑到个体间的本底差异，最低可测限约为0.5 Gy，由于DNA单链断裂会迅速恢复，这种分析只适合在照后1 h内进行；碱基损伤可测出的剂量范围在1～10 Gy，适宜分析的时间在照后1～4 h。邢（Xing）等用抗胸腺嘧啶乙二醇（thymine glycol）抗体的间接免疫荧光标记法，利用激光诱导的荧光分析毛细管电泳测定DNA碱基损伤来确定照射剂量和监测损伤碱基的消除过程，通过定量分析照射后细胞内胸腺嘧啶乙二醇的产生，可监测2 Gy以内的照射剂量。
5.5.6.3 基因表达和突变分析
为建立准确、快速、高通量、易推广的生物剂量监测系统，某放射生物学研究所近年来将基因表达和突变分析作为重点研究内容之一。(https://www.daowen.com)
布莱克利（W.Blakely）等在发现c-haras基因表达随照射剂量增加而增加的基础上，利用实时逆转录5'-荧光核苷酸PCR方法再进行c-haras基因分析，发现1 Gy照射后c-haras基因表达量是未照射对照的9倍之多，表明该基因有作为生物剂量标志的潜能。
格蕾丝（M.Grace）等运用RT-PCR（实时定量逆转录聚合酶链式反应）测量照射后生长抑制DNA损伤基因45（growth arrest and DNA damage gene 45，gadd45）的表达，发现在0～3 Gy剂量范围内gad d45基因表达呈2～4倍线性上调，认为RT-PCR结合gadd45基因监测是一个快速、灵敏、重复性好的潜在生物剂量检测指标。此外，目前多家实验室已发现并报道了多个具有良好剂量响应关系的辐射诱导表达基因，如PIG3、XPC、ASTN2、CDKN1A、PCNA等，这些基因也具有发展成为辐射分子生物剂量计的潜力。
图5.22 单细胞凝胶电泳
外保田（N.Kubota）等用X射线照射两个辐射敏感性不同的人类鳞状细胞瘤细胞系和一个辐射敏感的共济失调毛细血管扩张症（ataxia telangiectasia，AT）细胞系，用定量PCR方法测定线粒体DNA 4 977 bp（mtDNA 4977）片段缺失，结果发现电离辐射（0～10 Gy）可特异诱导细胞株mt DNA 4977的发生，并有时间累积性，因此认为分析线粒体缺失有可能成为用于急性照射、回顾性和慢性受照的剂量重建的剂量计，10 Gy照射才可在具有辐射抗性的鳞状癌细胞系中诱导出可测的mt DNA 4977缺失片段，而在辐射敏感的鳞状癌细胞系只需2 Gy，在AT细胞系则只需1 Gy。
5.5.6.4 基因微阵列分析
各类高集成的功能基因芯片的发展和应用，为辐射诱导基因改变的生物学研究及辐射生物剂量标志物研究提供了平台。鉴于基因微阵列分析在临床肿瘤分类、诊断、治疗和预后中的应用，放射生物学家们也想搭上此技术的快车。阿蒙德森（Amundson）等利用cDNA微阵列杂交技术分析淋巴细胞辐射反应基因时发现，照射后24 h一些表达量增加的基因随时间延长而下降，而另有部分基因在照后72 h才开始显著升高。他们所观察到的表达量最高的基因是d db2。d db2、CDK N1A和XPC的表达在0.2～2 Gy照射剂量范围，照后24～48 h内与受照剂量有良好的线性关系，而在24 h前和48 h后这种线性关系均不存在。简（K.Jen）等利用寡核苷酸微阵列分析射线照射后24 h淋巴母细胞m RNA在不同时间点的表达水平，3 Gy和10 Gy照射后，分别确认到319和816个辐射反应基因，另有126个基因对两个剂量都有反应。这些基因大多数涉及细胞周期调控、细胞死亡、DNA修复、DNA代谢和RNA加工过程。然而，基因芯片虽有高信息集成、高通量分析的优点，但这项技术在放射生物学，尤其在电离辐射生物剂量的研究中仍裹足不前，难有进展。这可能是因为以下几点：首先，基因表达的个体差异、组织细胞类型差异、多种环境因素和机体的代谢状态，这些因素不可忽视。电离辐射虽被公认是强基因诱变剂，但这种诱变与射线的种类（不同LET）、照射剂量、剂量率、照射方式（离体、整体，局部、全身，急性、慢性，一次、分次等）、照射后的时间等因素有关，不同因素及不同因素的组合会产生大量不同的反应基因谱（profiles），而这些基因有些是上调的，有些是下调的，有些是在照后立即改变的，有些是照后不同时间逐渐或间断性改变的，有些是在不同的剂量和剂量率诱导下才出现改变的，有些改变则与照射剂量的大小和剂量率无关。此外，一些生理、病理、精神状态和其他内外环境因素也可诱导基因发生改变，这些改变有可能与电离辐射诱导的基因改变相互叠加，从而使得归类和建立一组特异的、用作标识辐射剂量的电离辐射反应基因谱十分复杂和困难。其次，在处理庞大复杂的微阵列分析数据方面也面临困难的选择。目前，虽有许多处理微阵列分析数据的方法和模型，如集束分析法、主要成分分析法、多维分级分析法、自组地图分析法、K-均值集束分析法等，但这些分析方法是根据不同实验要求和目的而设计的，都不是一种普遍适合的数据分析程序，而适合或符合电离辐射诱导的、复杂的基因微阵列分析数据分析程序目前尚未完全建立，现有结果所用分析程序都是随机使用的。最后，微阵列分析不能像实时PCR分析那样精确定量，在每个分析系统中的敏感性和重复性也不一样，有效标记所需的洁净、未降解和足量的RNA样本的制备也不是轻易能做好的，虽然目前有许多扩增或放大RNA量的技术，但这些技术的运用也带来了放大或扩增的RNA是否具有忠实代表性的问题。此外，昂贵的价格、分析所需时间长短及设备等问题都制约进一步深入研究。