TGF-β／BMP信号通路
骨组织抵抗骨折发生的能力与骨量、骨结构、骨力学特性和骨基质的组成成分等都有密切的关系。然而皮质骨厚度、松质骨量和松质骨的形态结构在骨组织形态结构中也具有重要的作用。骨组织中许多信号通路如TGF-β／Smads等，在调控骨量、骨组织形态结构以及骨组织疾病发生（如骨质疏松）中均具有重要的调控作用。目前，有关骨组织的力学特性是否与骨基质中由成骨细胞和骨细胞合成分泌的特殊蛋白和矿物质丰富的细胞外物质相关的研究较少，尚有很多不清楚之处尚待探究。然而，骨基质质量对于临床上的骨代谢紊乱，如成骨不全症、骨质疏松等都具有重要的意义。研究发现，激活TGF-β／Smads信号通路在调控骨形成代谢以及提高骨基质质量上均起着重要的作用。Kang等研究发现，Smad3被TGF-β激活后可上调其下游靶基因成骨特异性转录因子（runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨钙素（osteocalcin，OCN）等的表达，从而促进成骨细胞的分化及骨基质形成。另有研究证实，TGF-β／Smads信号通路还可调控骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶类等的表达。这些蛋白不仅在骨基质沉积和矿化中起着重要的作用，并且TGF-β也可调控这些蛋白的表达进而影响骨基质的特性。
由TGF-β主导的自分泌和旁分泌对成骨细胞前体细胞——干细胞，或者前体细胞的保持和增殖具有重要的作用。在骨和软骨内有TGF-β的大量表达，并且亦存在大量的TGF-β靶细胞。TGF-β可选择性地与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和Smad2／3信号通路，或者与甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、Wnt、BMP和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）信号通路相互作用促进成骨细胞前体细胞增殖、早期分化并作用于成骨细胞。TGF-β信号通路主要分为经典和非经典两条通路。
TGF-β亚型及其受体-Ⅰ型受体（TGF-βRI或ALK5）和Ⅱ型受体（TGFβRⅡ或Tgfbr2）在软骨内成骨和膜内成骨过程中起着重要的作用。当敲除TGF-β1后，骨生长和矿化受到显著抑制。而同时敲除TGF-β2和TGF-β3后的小鼠呈现肋骨远端缺失。而当对TGF-βR、TGFBR2进行条件敲除后，发现胫骨、颅骨、脊椎骨及软骨等出现发育障碍。说明TGFBR2在膜内成骨和软骨内成骨过程中都起着重要的作用。
TGF-β是一种具有多种功能的多肽生长因子，其与组织再生、胚胎发育、成骨细胞分化和骨组织代谢等多个生物学过程密切相关。在TGF-β信号通路中的R-Smad主要是Smad2和Smad3。TGF-β通过与膜上受体丝氨酸／苏氨酸激酶受体——TGF-βRⅡ结合并将其激活，活化后的TGF-βRⅡ激活膜内受体TGF-βRⅠ，磷酸化胞质内的细胞信号分子Smad2和Smad3。Smad2／3磷酸化后可与Smad4结合，形成信号转导复合体进入核内调控相关靶蛋白的表达。而激活Smad7是另一条调控R-Smad功能的信号通路。其可以靶向地调控TGF-β受体降解。Smad7发生突变后，可抑制Smad泛素化调节因子2（Smad ubiquitination regulatory factor 2，Smurf2）与其受体的结合及其活性。Smad7是TGF-β信号通路的调节因子之一，其可与Smad4竞争性地与Smad2／3形成复合体从而在骨形成代谢、骨吸收代谢以及出生后的骨代谢平衡中发挥重要作用。研究发现，TGF-β／Smad信号通路的靶基因主要包括Runx2、激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）、碱性亮氨酸拉链（basic region／leucine zipper motif，bZIP）、叉头框（forkhead-box，Fox）、碱性螺旋-环-螺旋蛋白（basic helix-loop-helix protein，b HLH）及Sp1等。其中细胞内的Smad蛋白家族主要分为3类：①受体激活型Smads（R-Smads）、②通用配体型Smads（Co-Smads）和③抑制型Smads（I-Smads）。近来，有研究发现，Smad2／3还可与肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptors 6，TRAF6）TGF-β激酶1（TGF-βkinase 1，TAK1）结合蛋白1（TAK1 binding protein 1，TAB1）-TAK1分子复合体直接相互作用。当抑制TGF-β信号通路后，未能观察到TRAF6-TAB1-TAK1分子复合体，提示TGF-β1在核因子-κb受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-k B ligand，RANKL）诱导破骨细胞（osteoclast，OC）分化过程中是必不可少的。当TGF-β1抑制成骨细胞分泌的RANKL（促进破骨细胞分化的重要细胞因子）的活性时，其可促进骨基质形成和成骨细胞分化。因此，TGF-β1通过间接地抑制破骨细胞形成来影响骨量。目前研究证实，TGF-β／Smads信号通路在调控骨形成代谢和骨吸收代谢中具有重要的调控作用。
非经典的不依赖于Smads的TGF-β信号通路在成骨细胞分化和骨形成过程中也扮演着重要的角色。在对三苯氧胺诱导的Cre-ER调控的ALK5缺失颅骨细胞进行培养时，TGF-β信号通路可选择性地与MAPKs和Smad2／3信号通路作用从而促进骨前体细胞增殖、早期分化，并作用于成骨细胞。作为MKK3-p38 MAPK信号通路上游的诱导因子，TAK1和TAB1在TGF-β1调控Ⅰ型胶原蛋白表达过程中具有重要的作用。TAK1在调控MKK3和p38 MAPK蛋白水平稳定性上起着非常经典的作用。最近有研究证实，在TGF-β诱导下，Smad和p38MAPK信号通过共同作用于Runx2，从而调控MSCs前体细胞的分化。另外，细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和p38也可分别作用于成骨细胞内的TGF-β和BMP-2的表达及功能发挥。TGF-β2诱导的ERK-MAPK是一条重要的信号通路，可通过刺激细胞增殖来增加骨祖细胞数量，从而促进骨祖细胞分化为成骨细胞，实现颅骨快速增长。目前，有关TGF-β／BMP信号通路调控骨形成代谢的相关研究较少，其分子机制尚不明确。
TGF-β信号通路与BMPs信号通路之间存在着密切的相互调控关系。TGF-β可强烈地增强BMP-2诱导的异位骨形成，其骨量是BMP-2单独诱导的5倍。体外研究发现，TGF-β1、FGF-2和血小板衍生生长因子AB（platelet derived growth factor-AB，PDGF-AB）上调BMPR-IB后可显著增强BMP-2诱导的骨形成功能。在研究BMP-9诱导C3H10T1／2细胞向成骨细胞方向进行分化时，发现BMPRⅡ和ActRⅡ是TGF-β的Ⅱ型功能受体。该研究表明，TGF-β1和BMP信号通路在成骨细胞分化过程中存在紧密的联系。BMPs在骨形成过程中的生物学作用已在很多研究中证实。研究发现，BMPs可促进小鼠骨缺失的修复。近年研究发现，在成骨细胞分化和骨形成过程中BMP信号通路与Wnt、Notch、FGF和Hh信号通路也存在密切的相互关系。(https://www.daowen.com)
BMP-2、4、5、6和7在调控成骨细胞分化和骨形成过程中均具有重要的作用。另外，BMP-2可上调OCN表达，并且短期的BMP-2表达上调可显著促进成骨细胞分化和骨形成BMP-7可诱导成骨细胞分化标志物表达，如上调碱性磷酸酶（ALP）活性，且会加快钙离子的矿化。用Prx1-Cre模型进行体内基因研究证实，BMP-7缺失对于出生后四肢的生长和骨量的保持作用并不是很明显，提示成年骨组织内还存在其他的BMPs来弥补BMP-7缺失对骨造成的影响。而当敲除BMP-2和BMP-4后，骨形成受到显著抑制。然而，当BMP-4缺失时四肢骨形成仍然正常，提示BMP-4对于四肢骨的骨形成代谢和功能并不是必不可或缺的。小鼠四肢骨不能合成分泌BMP-2容易导致自主性骨折，即使对骨施加其他的骨形成刺激也不能弥补BMP-2缺失对骨产生的影响。在软骨发育过程中，BMP-2（而不是BMP-7）在软骨细胞增殖和成熟过程中扮演着重要的角色。有研究发现，BMP-3缺失小鼠的松质骨骨量是野生型小鼠的2倍其可抑制骨组织前体细胞分化为成熟成骨细胞，并调节成年后骨量变化。
如BMP-2的受体BMPR-Ⅱ可分别调节靶基因对BMP-2的作用，在2T3细胞内，BMPR-Ⅱ和Act R-ⅡB在功能上可相互补充以调节BMP-2信号通路和BMP-2诱导的成骨细胞分化。用Prx1-Cre技术敲除小鼠BMPR-Ⅱ后，其骨组织发育正常，提示BMPR-Ⅱ对于四肢骨的发育不是必不可少的。另一种机制与BMP与其他的Ⅱ型BMP受体相结合从而弥补了BMPR-Ⅱ敲除后对骨发育的影响。相反，当用Col1-Cre技术将BMPR-IA敲除后，小鼠的骨体积变大，四肢变短，肢体远端发育不全，身体变小，不规则钙化和低骨量等。而有研究发现，松质骨骨量的增加可能与骨保护素（osteoprotegerin，OPG）／核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）／核因子-κB受体活化因子（receptor activator nuclear factor-κB，RANK）信号通路抑制了破骨细胞形成有关。
Neogenin是一种膜上蛋白，在BMP诱导的经典信号通路即磷酸化Smad1／5／8过程中可通过与脂质筏相结合从而发挥其调控作用。BMP信号通路过表达可通过ALK2导致Smad1／5／8的磷酸化异常，成骨细胞特异性敲除的小鼠呈现骨质减少和BMP信号通路受到部分抑制等特征。而Smad1／5／8不能正常结合可导致严重的软骨发育异常。当Smad1被修饰后，其可调节BMP调控的骨形成，并且BMP信号通路的作用强度可被BMP受体通过Smad1的C端磷酸化来进行调控。综上，以上研究表明Smad1／5／8是成骨细胞内的信号蛋白，可被BMP诱导，从而发挥BMP信号通路的生物学调控作用。
Smad4是TGF-β和BMP信号通路唯一共有的Smad。在小鼠体内，靶向地使Smad4失去功能会导致大量的发育缺陷和多种组织上的肿瘤形成。当在小鼠体内敲除Smad4基因时，小鼠在胚胎的7.5～9.5天就会死亡，并且头部结构和前期的胚胎结构都不会形成，同时还会抑制TGF-β诱导的相关基因表达。Smad4不仅在调控TGF-β信号通路上具有重要的作用，而且在抑制肿瘤形成上也具有重要作用。成骨细胞上条件性地敲除Smad4导致骨密度降低，骨体积降低，骨形成率降低和成骨细胞数量减少。Smad4是调节骨形成的一个非常重要的靶点。研究发现，一方面，FAM和Ectodermin／Tif1 gamma（Ecto）能特异性地调节Smad的去泛素化和泛素化；另一方面，Smad6可与R-Smad竞争性地结合并与Smad4形成一个不具有生物学功能的生物复合体，而Smad4在骨形成代谢过程中会抑制BMP信号通路。Smad6在调节BMP信号通路的一个负反馈调节环路中发挥着重要的作用，并且在软骨内成骨中抑制BMP信号通路。与Smad6敲除小鼠相比，Smad6／Smurf1双敲除的小鼠表现为严重的软骨内成骨障碍。Smurf1通过其ww区域与Smad6的PY motif进行特异性结合，并将Smad6转入细胞质中。而当Smad6处于未激活状态时，主要位于核内。
经典的BMP信号通路在骨形成代谢中的重要作用已在很多研究中被证实，然而非经典的BMP信号通路在骨形成代谢中也扮演着重要的角色。TAK1可通过轻微调控BMP信号通路进而影响骨生长发育和骨形成。成骨细胞上特异性敲除Tak1后会导致锁骨发育不全，这与人体Runx2单倍不足呈现的锁骨和颅骨发育不全的表型相一致。其生物学机制与TAK1-MKK3／6-p38 MAPK磷酸化Runx2，进而促进其与调控成骨细胞基因编码的共激活剂环磷腺苷效应元件结合蛋白结合（c AMP-response element binding protein，CREB）有关。研究发现，敲除TAK1后其不仅激活p38信号级联通路，而且会激活BMP信号通路的Smad1／5／8。在BMP信号通路中，Smad和MAPK信号通路可通过协同作用调控四肢骨发育。Runx2和TGF-β／BMPs激活Smads相互之间的协调作用对于骨组织形成代谢具有重要的作用。TGF-β／BMP、MAPK信号通路和Runx2三者之间的相互调控对于促进骨形成代谢具有重要的作用。
综上，当TGF-β／BMP信号通路被激活后可通过调控其下游的Smad途径，进而入核调控相关靶基因表达来影响成骨细胞分化、成熟及成骨能力，影响骨形成代谢。