运动对T2DM小鼠骨中GPR48／RANKL途径、CN／NFAT途径及骨吸收代谢作用的影响
患T2DM后，对小鼠骨组织新陈代谢会产生重要的负向调控作用，在使得小鼠骨形成代谢受到显著抑制的同时也会显著促进骨吸收代谢，而导致骨质疏松发生。目前，生物学研究中，有的发现患T2DM后，会使得机体内破骨细胞分化显著增多且骨吸收能力显著增强，而有的研究却发现T2DM对破骨细胞分化及其骨吸收能力的影响并不显著。研究发现，T2DM造模成功8周后，小鼠骨中GPR48表达下调，并且OPG／RANKL／RANK分子轴及其下游CN／NFAT信号通路被激活，从而使得分化产生的破骨细胞显著增多，骨吸收代谢显著增强。在骨代谢中，骨形成代谢与骨吸收代谢之间既相互联系又相互作用。运动训练可显著促进T2DM小鼠的骨形成代谢，那么运动训练是否可显著抑制T2DM小鼠的骨吸收代谢呢？其生物学机制是否与骨中GPR48、OPG／RANKL／RANK分子轴及其下游CN／NFAT信号通路有关呢？基于以上问题，本节研究利用高脂膳食加注射STZ的方法进行T2DM小鼠造模并利用游泳和下坡跑两种不同方式运动对T2DM小鼠进行为期8周的运动训练，训练结束利用颅骨TRAP染色、RT-PCR、Western-blotting、破骨细胞原代培养等方法，对GPR48在不同方式运动调控T2DM小鼠骨吸收代谢中的生物学作用进行探究，从骨吸收这一方面解释运动训练调控T2DM小鼠骨代谢的生物学机制。
1.材料与方法
实验动物同第二章第四节；实验动物造模和训练同本章第一节；主要试剂、仪器、试剂配制方法以及实验指标检测同第三章第二节。
2.实验结果
1）不同方式运动对T2DM小鼠骨组织中GPR48表达的影响
由图4-22和表4-22可知，与TC组相比，TS组和TD组GPR48 mRNA和蛋白表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01）；与TS组相比，TD组GPR48蛋白表达显著上调（P＜0.05）。
图4-22 不同运动组T2DM小鼠骨中GPR48蛋白表达条带图
表4-22 不同运动组T2DM小鼠骨中GPR48表达的比较（
）
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05。
2）不同方式运动对T2DM小鼠IP3和Ca2＋浓度的影响
由表4-23可知，与TC组相比，TS组Ca2＋浓度均显著下降（P＜0.05），而IP3浓度虽下降但差异不具有显著性（P＞0.05）；TD组IP3和Ca2＋浓度均显著下降（P＜0.05）。与TS组相比，TD组IP3和Ca2＋浓度均显著下降（P＜0.05）。
表4-23 不同运动组T2DM小鼠IP3和Ca2＋浓度的比较（
）
注：与TC组相比，*P＜0.05；与TS组相比，△P＜0.05。
3）不同方式运动对T2DM小鼠骨中骨吸收相关细胞因子mRNA表达的影响
由表4-24可知，与TC组相比，TS组OPG、RANKL、TRAF6、CN、PLC、NFATc2、TRAP、c-fos、CTSK和PU.1的mRNA表达均出现显著变化（P＜0.05或P＜0.01），而RANK、Src-1、Src-3、NFATc1和AP-1的mRNA表达呈变化趋势但差异不具有显著性（P＞0.05）；TD组OPG、RANKL、RANK、TRAF6、CN、Src-3、PLC、NFATc2、NFATc1、TRAP、c-fos、AP-1、CTSK和PU.1的mRNA表达均出现显著变化（P＜0.05或P＜0.01），而Src-1的mRNA表达却不具有显著性差异（P＞0.05）。与TS组相比，TD组OPG、TRAF6、Src-3、PLC、TRAP、c-fos、CTSK和PU.1的mRNA表达变化具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），而RANK、RANKL、CN、Src-1、NFATc2、NFATc1和AP-1的mRNA表达虽有变化但差异不具有显著性（P＞0.05）。
表4-24 不同运动组T2DM小鼠骨中骨吸收细胞因子mRNA表达的比较（
）
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05，△△P＜0.05。
4）不同方式运动对T2DM小鼠骨组织中骨吸收相关细胞因子蛋白表达的影响
由图4-23和表4-25可知，与TC组相比，TS组RANKL、c-fos和c-Src的蛋白出现显著变化（P＜0.05或P＜0.01），而RANK和TRAF6虽出现变化但差异不具有显著性（P＞0.05）；TD组RANKL、c-fos、c-Src、RANK和TRAF6的蛋白出现显著变化（P＜0.05或P＜0.01）。与TS组相比，TD组RANK和TRAF6的蛋白出现显著变化（P＜0.01），而RANKL、c-fos和c-Src的蛋白表达虽出现变化但差异不具有显著性（P＞0.05）。
图4-23 不同运动组T2DM小鼠骨中骨吸收细胞因子蛋白表达条带图
表4-25 不同运动组T2DM小鼠骨吸收相关细胞因子蛋白表达的比较（
）
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05，△△P＜0.05。
5）不同方式运动对T2DM小鼠破骨细胞分化及相关因子表达的影响由图4-24所示可知，与TC组相比，TS组破骨细胞数量显著减少且3个核以上的破骨细胞数量显著减少；TD组破骨细胞数量显著减少且3个核以上的破骨细胞数量显著减少。与TS组相比，TD组破骨细胞数量以及核为3个以上的破骨细胞数量也出现显著下降。
图4-24 不同运动组T2DM小鼠分化产生的破骨细胞(https://www.daowen.com)
由表4-26可知，与TC组相比，TS组小鼠BMSCs分化产生的成骨细胞中GPR48的mRNA均出现显著变化（P＜0.05），但TRAP、PU.1、NFATc1、cfos和c-Src的mRNA表达下调但差异不具有显著性（P＞0.05）；TD组GPR48、TRAP、NFATc1和c-Src的mRNA均出现显著变化（P＜0.05或P＜0.01），而PU.1和c-fos mRNA表达不具有显著性（P＞0.05）。与TS组相比，TD组GPR48的mRNA均出现显著变化（P＜0.05），而TRAP、NFATc1、PU.1、c-fos和c-Src的mRNA表达虽出现变化但差异不具有显著性（P＜0.05）。
6）不同方式运动对T2DM小鼠颅骨和股骨TRAP染色的影响
由图4-25（彩图见附录）所示可知，与TC组相比，TS组和TD组小鼠颅骨人字缝和股骨骺线位置的TRAP活性显著降低。与TS组相比，TD组小鼠颅骨人字缝和股骨骺线位置的TRAP活性亦出现显著下降。
表4-26 不同运动组T2DM小鼠破骨细胞中相关因子mRNA表达的比较（
）
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05，△△P＜0.05。
3.讨论分析
1）不同方式运动对T2DM小鼠骨中GPR48表达的影响
骨组织中分化产生的破骨细胞数量多少以及功能强弱与骨吸收代谢存在着密切的关系。影响骨吸收代谢的因素很多，包括各种信号通路、细胞因子、激素等。GPR48是调控骨代谢的重要膜上蛋白GPR48，当敲除GPR48后，小鼠出现骨量和BMD下降，使得骨生长发育受到显著抑制。说明GPR48在小鼠骨吸收代谢中起着重要的调控作用。但是，其在研究中并没有对GPR48调控骨吸收代谢的相关生物学机制进行探讨。目前，在GPR48调控骨吸收代谢方面的相关研究尚未见报道。T2DM是一种代谢性疾病，患T2DM后会导致骨质疏松的发生。目前国内外相关研究较多，T2DM使得大鼠骨量显著下降，导致骨质疏松发生。研究也发现，T2DM小鼠在骨形成代谢受到抑制的同时也会促进骨吸收代谢，使得骨量显著下降。本研究也发现，T2DM小鼠的股骨远端骨密度显著下降。然而目前有关T2DM骨中GPR48表达的研究还鲜有报道，本研究发现T2DM骨中GPR48表达显著下调。运动是一种可以改善T2DM骨代谢的有效方式，研究证实运动训练可显著促进T2DM骨健康。
本研究中，TS组和TD组GPR48表达显著上调，说明运动训练可显著上调T2DM骨中GPR48表达。究其原因，与运动训练促进T2DM患者体内胰岛素浓度增加有关。由于体育领域内有关调控T2DM骨中GPR48表达的相关研究尚未见报道，其生物学机制尚待深入研究。与TS组相比，TD组T2DM小鼠骨中的GPR48表达显著上调，说明与游泳运动相比，下坡跑可更好地激活T2DM小鼠骨中GPR48表达。这与下坡跑对T2DM小鼠骨产生较大强度的直接作用力存在密切关系。
图4-25 不同运动组T2DM小鼠颅骨和股骨TRAP染色结果
2）不同方式运动对T2DM小鼠骨组织中OPG／RANKL／RANK分子轴相关细胞因子mRNA表达的影响
研究发现，RANKL是到目前研究发现的调控破骨细胞分化、发育和骨吸收能力的唯一细胞因子。RANK为膜上跨膜受体，是RANKL发挥其生物学作用的膜上唯一受体。OPG是肿瘤坏死因子（TNF）家族的成员之一，亦被称为破骨细胞抑制因子，其可RANKL竞争性地与RANK结合，从而抑制破骨细胞分化和骨吸收功能以及促进骨形成代谢。研究发现，OPG／RANKL／RANK分子轴在调控破骨细胞分化、成熟及骨吸收功能上扮演着重要的角色。即使在体外条件下，OPG／RANKL／RANK分子轴仍是破骨细胞分化的潜在激活因素。破骨细胞前体细胞不仅需要生长因子M-CSF来维持其生长，而且也需要RANKL来诱导其分化，并诱导转录因子c-fos、NFATc1／NFATc2和NF-κB成员p50及p52的表达，RANK也可通过激活破骨细胞前体细胞中的c-fos和NFATc1／NFATc2以促进破骨细胞分化、成熟。另外，有很多细胞因子如IL-1、IL-6和IL-11等被很多研究证实，它们可通过诱导成骨细胞表达RANKL从而作用于破骨细胞形成。细胞因子TNF-α不仅可通过直接刺激破骨细胞前体细胞，而且还可通过诱导干细胞表达RANKL和破骨细胞前体细胞表达RANK来促进破骨细胞的形成。调控骨吸收代谢的另一重要细胞因子——TRAF6。研究发现，敲除TRAF6后会导致严重的骨质疏松，这证实TRAF6与OPG／RANKL／RANK信号通路之间存在密切的关系。另一研究检测了RANK受体上的TRAF结合位点，说明TRAF6可能在破骨细胞功能发挥和正常的F-actin指环形成上起着重要的作用，并且其他TRAF参与信号通路可能对RANK调控破骨细胞形成起着重要的作用。研究证实，破骨细胞中RANK信号通路的下游TRAF6可激活JNK1、Akt／PKB、p44／42ERK、p38MAPK和经典NF-κB通路。c-Src通过调控的RANK激活，而参与正常的破骨细胞发育中。在一项有关破骨细胞分化的研究中，发现了一个对RANK信号通路的共刺激信号通路，该通路包括含有12 k Da（DAP12）和Fc受体g亚基（FcRg）的DNAX免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine based activation motif，ITAM）。这个共刺激信号通路通过激活下游蛋白酶（Syk）以激活磷酸化酶Cg（PLCg）、BTK和Tec激酶等来参与RANK调控破骨细胞的形成，甚至导致NFATc1／NFATc2的钙离子调控的相关通路激活。综上所述，OPG／RANKL／RANK分子轴可通过调控其下游的相关靶基因的表达，从而通过不同的途径影响破骨细胞分化、成熟以及骨吸收功能进而影响骨吸收代谢。目前有关T2DM调控骨中OPG／RANKL／RANK分子轴相关细胞因子表达的研究发现，在T2DM大鼠牙槽骨中OPG表达下调，而RANK和RANKL表达显著上调。人体研究中，曾晓燕的学位论文中论述了T2DM患者血清中RANKL表达升高，而OPG／RANKL比值下降相关内容。动物和人体研究均发现T2DM会影响骨组织中OPG、RANKL和RANK的表达。而在国内外体育领域内，有关运动训练调控T2DM骨中OPG、RANKL和RANK表达的相关研究尚鲜有报道。
本研究中，TS组和TD组的OPG、RANKL和RANK的mRNA表达均出现显著变化，说明游泳和下坡跑可显著抑制OPG／RANKL／RANK分子轴从而抑制骨吸收代谢。究其原因，与本研究中游泳和下坡跑可激活GPR48表达有关。因为GPR48与OPG／RANKL／RANK分子轴之间存在密切的调控关系，当该基因激活后会竞争性地与RANKL结合从而显著抑制骨吸收代谢。本研究观察到，运动训练可显著促进成骨细胞分化产生及其成骨能力有关，当分化产生的成骨细胞数量增多且成骨能力增强时，由其分泌产生的RANKL和OPG也都会显著增多。运动训练可促进小鼠机体内胰岛素分泌增加。Wędrychowicz等研究证实，当胰岛素浓度增加时会显著抑制OPG／RANKL／RANK分子轴中相关细胞因子表达。小鼠机体内激素水平的变化可能是抑制OPG／RANKL／RANK分子轴的重要原因之一，当PTH分泌增加时可显著上调成骨细胞分泌的RANKL和OPG。再者可能与运动抑制炎症因子IL-6的表达有关，当IL-6表达下调后gp130信号因子调节RANKL和OPG表达，进而影响RANK。而与TS组相比，TD组OPG／RANKL／RANK分子轴表达出现显著变化，说明与游泳运动相比，下坡跑能更好地抑制该信号通路从而抑制骨吸收代谢。究其原因，与下坡跑能促进胰岛素和PTH等激素分泌增加有关，也与其能抑制IL-6表达有关。
3）不同方式运动对T2DM小鼠骨组织中CN／NFAT信号通路相关细胞因子mRNA表达的影响
CN／NFAT信号通路是破骨细胞中OPG／RANKL／RANK分子轴的下游信号通路之一。NFAT是一种钙离子调节性转录因子，CN活化后，迅速转录进入细胞核内并与相应的靶基因结合，调控其转录进而影响破骨细胞的分化、成熟以及骨吸收功能。目前有关CN／NFAT信号通路调控破骨细胞分化、成熟以及骨吸收代谢的相关研究较少。研究证实，CN／NFAT信号通路调控破骨细胞分化及骨吸收能力。目前国内外有关CN／NFAT信号通路调控T2DM骨代谢的相关尚鲜有报道。很多生物学机制尚不是很清楚，需要在以后的相关研究中继续进行深入探究。研究发现，运动训练可调控T2DM骨代谢，改善T2DM骨质疏松。而有关运动通过CN／NFAT信号通路调控T2DM骨代谢的相关研究鲜有报道。
本研究中，与TC组相比，TS组和TD组CN／NFAT信号通路及其下游相关细胞因子表达均受到显著抑制，说明运动训练可显著抑制T2DM小鼠骨中CN／NFAT信号通路及其下游相关细胞因子表达。这与本研究中，运动训练可限制抑制OPG／RANKL／RANK分子轴有关，因为CN／NFAT信号通路作为其下游信号通路，当OPG／RANKL／RANK分子轴被抑制后也会抑制其下游CN／NFAT信号通路及相关细胞因子的表达。CN／NFAT信号通路及相关细胞因子的表达变化与肌球蛋白重链（My HC）有关，激活My HC表达可显著抑制CN／NFAT信号通路表达。也可能与运动上调TAK1（TGF-β激酶-1）表达有关，TAK1表达上调会抑制其下游NFAT等细胞因子表达。与TS组相比，TD组CN／NFAT信号通路及其下游相关细胞因子表达都出现显著下调，说明与游泳运动相比，下坡跑运动能更显著地抑制该信号通路及其下游细胞因子表达。这与下坡跑可能显著抑制OPG／RANKL／RANK分子轴、My HC及TAK1等细胞因子表达密切相关。由于目前相关研究较少，其生物学机制尚不清晰，缺少直接的研究证据。
4）不同方式的运动对调控T2DM小鼠BMM向破骨细胞分化的细胞因子表达的影响
破骨细胞主要由BMM分化产生，其分化过程分为：①早起分化阶段，即HSC分化为向某特定细胞分化的造血祖细胞；②造血祖细胞向破骨细胞前体分化；③造血祖细胞向TRAP阳性的单核前破骨细胞分化；④单核破骨细胞融核形成多核破骨细胞。在破骨细胞分化产生的每个阶段都受到很多细胞因子的调控，如PU.1在HSC向破骨前体细胞分化中起着重要调控作用，TRAF6、NFATc1和c-fos在破骨前体细胞向单核破骨细胞分化并且在后期的融核形成多核破骨细胞中均起重要调控作用，c-Src在破骨细胞的骨吸收功能调节上具有重要的作用等。GPR48为众多信号通路或细胞因子的上游，在破骨细胞分化及骨吸收功能发挥重要的调控作用。而TRAP是评价破骨细胞骨吸收功能重要标志物。生物学领域内，有关以上细胞因子在调控破骨细胞分化及骨吸收功能上的相关研究较多，在此不再赘述。患T2DM会促进分化产生的破骨细胞的数量及骨吸收功能和骨吸收代谢显著增强，而导致骨质疏松甚至骨折的发生。然而在体育领域内，有关运动训练调控T2DM小鼠分化产生的破骨细胞中相关细胞因子表达的相关研究尚鲜有报道。
本研究中，与TC组相比，TS组和TD组破骨细胞中的相关细胞因子mRNA表达均显著下调。说明游泳和下坡跑这两种运动方式均可显著抑制调控破骨细胞分化产生及其功能相关细胞因子的表达。究其原因，可能与本研究中游泳和下坡跑可显著上调GPR48表达有关，GPR48为很多信号通路或细胞因子上游的膜上七次跨膜受体，其激活后会显著抑制其下游调控破骨细胞分化及骨吸收功能的相关因子表达。也可能与游泳和下坡跑可显著抑制OPG／RANKL／RANK分子轴有关，当该分子轴受到显著抑制时会下调其下游相关细胞因子表达。与TS组相比，TD组破骨细胞中的相关细胞因子mRNA表达均显著下调。说明下坡跑运动抑制T2DM小鼠体外培养的破骨细胞中相关细胞因子表达作用的影响优于游泳运动。这与下坡跑运动强度较大且对小鼠骨组织形成的力学刺激为直接力学刺激有关，较大强度的直接力学刺激可显著抑制OPG／RANKL／RANK分子轴及其下游CN／NFAT信号通路，从而抑制小鼠的破骨细胞分化，使得分化产生的破骨细胞相关调控因子mRNA表达显著下降。
5）不同方式的运动对T2DM小鼠破骨细胞分化的影响
破骨细胞与成骨细胞为骨中最重要的两种细胞，破骨细胞在骨组织中主导骨吸收代谢。破骨细胞主要由HSC分化产生，为多核细胞，在一定程度上细胞核的数量越多表明其骨吸收能力越强。研究发现，破骨细胞分化受到很多因素的影响，T2DM使得骨组织新陈代谢出现紊乱，而使骨吸收代谢显著增强。目前国外有关T2DM影响破骨细胞分化的相关研究鲜有报道。国内研究发现，T2DM大鼠骨髓HSC分化产生的破骨细胞数量显著增多。王燕在研究中发现，体外培养的T2DM大鼠破骨细胞数量显著增多。目前国内有关T2DM破骨细胞分化及其骨吸收功能的相关研究较多，均证实T2DM可显著促进破骨细胞分化并使得其数量显著增多。然而目前体育领域内有关运动训练调控T2DM小鼠破骨细胞分化的相关研究鲜有报道。
本研究中，8周训练后取T2DM小鼠骨髓HSC进行原代培养并利用MCSF和RANKL诱导其向破骨细胞进行分化。结果发现，与TC组相比，TS和TD组破骨细胞数量显著减少，说明运动训练抑制T2DM小鼠破骨细胞的分化产生。究其原因，可能与运动训练可显著促进T2DM小鼠成骨细胞分化有关，研究发现，当成骨细胞分化增多时会抑制破骨细胞的分化产生及骨吸收功能。这有可能与运动训练可抑制PI3K／Akt信号通路有关，当该信号通路受到抑制时会下调其下游GSK-3β、NFATc1等细胞因子从而抑制破骨细胞分化。还可能与运动训练促进RANKL表达有关，因为RANKL可通过抑制下游的PI3K／Akt、ERK信号通路和DAP12，以抑制破骨细胞分化。与TS组相比，TD组分化产生的破骨细胞数量显著减少，说明下坡跑抑制破骨细胞分化产生的作用大于游泳。分析其原因，与下坡跑运动可显著促进成骨细胞分化有关，也与运动训练可显著抑制PI3K／Akt和ERK信号通路以及DAP12有关。
6）不同方式运动对T2DM小鼠骨吸收能力的影响
TRAP是由破骨细胞分泌产生的，是评价骨吸收代谢的重要生化标志物之一。当骨吸收代谢增强时骨组织中的TRAP活性会显著提高。骨吸收代谢受到很多因素的影响，如激素水平、疾病等。研究证实，T2DM机体在骨形成代谢受到显著抑制的同时也会使得骨吸收代谢显著增强，而导致骨质疏松症甚至是骨折的发生。研究发现，T2DM小鼠因骨量显著下降，而出现骨质疏松症状。高海宁等研究发现，6周游泳运动可显著抑制T2DM大鼠血清中的TRAP活性，说明运动训练可显著抑制TRAP活性。
本研究中，与TC组相比，TS组和TD组小鼠颅骨和股骨的TRAP活性受到显著抑制，说明游泳和下坡跑可显著抑制T2DM小鼠TRAP活性及破骨细胞活性。这可能与本研究中游泳和下坡跑可显著提高小鼠机体内的胰岛素水平有关，因为胰岛素浓度提高后在提高骨形成代谢的同时也会抑制骨吸收代谢，还可显著抑制OPG／RANKL／RANK分子轴及其下游的CN／NFAT信号通路有关，以上信号通路被激活会抑制破骨细胞分化及骨吸收功能，使得破骨细胞分泌产生的TRAP酶显著减少，并使其活性下降。而与TS组相比，TD组的TRAP活性也出现显著下降。说明下坡跑可显著抑制T2DM小鼠TRAP活性及其骨吸收能力，且其作用效果优于游泳运动。这可能与下坡跑对T2DM小鼠骨组织产生的较大强度的直接力学刺激更能显著的抑制破骨细胞分化及其功能有关，分化产生的破骨细胞数量减少及其功能降低使得分泌产生的TRAP显著减少，TRAP活性显著降低。也可能与下坡跑能更好地促进胰岛素分泌并抑制OPG／RANKL／RANK分子轴及下游的CN／NFAT信号通路有关，因为抑制OPG／RANKL／RANK分子轴及其下游的CN／NFAT信号通路可显著抑制破骨细胞的分化并使得骨吸收功能显著下降，从而导致T2DM小鼠颅骨和股骨TRAP活性显著下降。综上所述，下坡跑可显著抑制T2DM小鼠骨组织TRAP活性且其作用优于游泳运动。
4.结论
（1）8周运动训练可显著抑制T2DM小鼠的骨吸收代谢，其生物学机制可能与运动激活GPR48表达而抑制OPG／RANKL／RANK分子轴及其下游CN／NFAT信号通路中相关细胞因子表达，从而抑制破骨细胞分化产生及骨吸收代谢。
（2）下坡跑运动抑制T2DM小鼠骨吸收代谢的作用优于游泳。