表观遗传学在骨形成中的作用机制
1.DNA甲基化对骨形成作用的影响
DNA甲基化是表观遗传学的研究热点，分为维持甲基化和从头甲基化，都呈现甲基在供体分子间级联反应的一碳代谢过程中。S-腺苷甲硫氨酸（Sadenosylmethionine，SAM）由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化反应中将其甲基基团供给胞嘧啶，此位点位于CpG岛二核苷酸胞嘧啶的5号碳原子（C5）。CpG岛是基因中胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）大量存在的二核苷酸重复序列，C和G通过磷酸二酯（p）相连，CpG岛与基因启动子的功能高度相关。研究证实，基因启动子中CpG岛密度越高，DNA甲基化程度对其转录水平的制约就越强。DNA甲基化可以通过多种方式调控基因表达：①发生甲基化的DNA与转录因子结合发生障碍。由于在DNA双螺旋结构的大沟内存在含有CpG位点的启动子序列，且该处是许多转录因子与DNA集合的位置，当此处发生甲基化后，一些对甲基化敏感的转录因子，如核转录因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）、转录因子2（E2 Factor，E2F2）等与识别位点结合发生障碍，而抑制转录过程，干扰基因表达。②甲基CpG结合蛋白（methyl-CpG binding protein，MeCPs）对基因表达的抑制或沉默。MeCPs是特异性转录抑制物，并以蛋白复合体的形式发挥作用，包括MeCP1和MeCP2两种甲基CpG结合蛋白复合体，而后者对单一的甲基化CpG位点高度亲和，当转录因子启动子识别序列中CpG位点发生甲基化时，其会与转录因子竞争甲基化结合位点，从而导致基因表达受影响。③DNA甲基化引起染色质结构改变，抑制基因表达。发生DNA甲基化后，组蛋白H3，H4氨基端赖氨酸残基出现去乙酰化，核小体结构受到影响，并改变组蛋白H1的连接活性来调节基因活性。另外，DNA甲基化会阻止转录因子进入而诱导染色质失活，防止染色质活化。一般认为，高甲基化的DNA序列表达水平低；反之，表达水平高。DNA甲基化水平在甲基化和去甲基化的共同作用下保持动态平衡，而衰老、饮食、运动、内分泌干扰物、细菌感染等外界环境因素都会引起DNA甲基化发生变化，从而引起各种疾病的发生。
1）单基因水平中的DNA甲基化
成骨细胞来源于MSC分化，在MSC成骨分化过程中往往伴随着关键因子的DNA甲基化变化，目前研究较多的包括Runx2、Osx、ALP、BMP-2等。Runx2在MSC成骨分化中起初始调节器的作用，随后通过Osx调节，ALP与OCN分别代表早期与晚期的成骨标志物。Runx2表达与其甲基化率呈负相关，该甲基化区域位于Runx2启动子—2.7至—2.2 kb，是新发现的差异甲基化区域，在诱导MSC向成骨分化后，Runx2此区域甲基化修饰程度降低且表达上升，这与其他研究相似，提示Runx2甲基化变化对成骨分化有重要作用。但HAGH等在人BMSC成骨分化中并未发现Runx2启动子出现甲基化，反观其下游靶点Osx启动子出现动态甲基化变化，这与上述研究相矛盾，但这是否说明Osx的DNA甲基化修饰在MSC成骨分化中起主要作用的论点仍有待研究，造成此差异的原因可能与实验对象、环境等有关。
此外，BMP-2作为关键骨形成因子，能在体外刺激成骨细胞分化和成骨结节形成，以及在体内刺激成骨。研究表明，BMP-2也受DNA甲基化调控。RAJE等发现，与健康人群相比，骨质疏松症患者BMP-2启动子区甲基化水平较高，使其转录活性降低，同时降低了骨形成标志物表达，在使用DNA甲基化抑制剂处理之后BMP-2表达上调。另外，一些其他的成骨特异性基因如远端缺失同源盒基因5、OCN等在脂肪源性干细胞成骨分化中，其启动子区发生去甲基化并伴随着基因表达上调，在此过程中还伴随着生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白的表达增加，在降低DNA损伤诱导蛋白表达后，成骨特异性基因启动子甲基化水平升高，导致转录活性降低并抑制了脂肪源性干细胞向成骨分化，这说明DNA损伤诱导蛋白参与了DNA甲基化对基因表达的调控过程。
骨硬化蛋白是硬化蛋白基因编码由骨细胞通过旁分泌作用于成骨细胞的功能蛋白，对骨组织具有高度选择性，可负性调节骨形成。硬化蛋白基因也受DNA甲基化调控，其基因—581—＋30区富含CpG，在成骨细胞中该区域呈现高甲基化，而随着向骨细胞转变其甲基化水平逐渐降低；通过使用5-氮胞苷（甲基转移酶抑制剂）处理后，硬化蛋白基因表达增加并促进成骨细胞向骨细胞转变。研究表明，绝经后骨质疏松患者血浆硬化蛋白甲基化阳性率显著低于无骨质疏松者，且前者硬化蛋白mRNA相对表达量明显高于后者，表明硬化蛋白基因甲基化异常导致骨质疏松症产生。此外，Osx等成骨转录因子可通过与硬化蛋白中CG富集点结合来活化硬化蛋白，对其进行正向调控进而影响骨形成过程，而DNA甲基化又在此过程中发挥重要作用。干扰素调节因子8（interferon regulatory factor 8，IRF8）是调控破骨细胞分化的关键负性调节因子，DNA甲基转移酶3a能通过增加IRF8远侧调节元件的甲基化进而抑制IRF8，同时S-腺苷蛋氨酸浓度增加能促进其甲基化。调节性T细胞可抑制破骨细胞分化及活性，影响骨代谢。调节性T细胞调节骨代谢依赖于Foxp3基因的正常表达，而Foxp3基因保守非编码序列2去甲基化有助于其稳定表达。研究表明，骨质疏松症患者调节性T细胞中Foxp3保守非编码序列2去甲基化水平远低于观察组。上述研究表明，DNA甲基化在MSC成骨分化以及成骨细胞、破骨细胞增殖分化中起重要作用。
2）Wnt／β-catenin、Notch信号通路与DNA甲基化
Wnt信号通路在干细胞成骨分化以及骨形成代谢中发挥重要作用。在经典Wnt／β-catenin通路中，Wnt蛋白与膜受体卷曲蛋白（Frizzled，Fz）结合，经过一系列蛋白的相互作用，使β-catenin稳定沉聚，并在细胞核内对T细胞转录因子和淋巴增强因子发生作用，通过启动Runx2及下游基因Osx、远端缺失同源盒基因5（distal-less homeobox genes 5，Dlx-5）等的表达来促进成骨细胞分化、成熟。研究表明，Wnt信号通路相关基因受到DNA甲基化调控。在对骨质疏松性髋部骨折患者和髋骨关节炎患者Wnt相关基因表达及其甲基化水平进行检测时，发现骨折患者Wnt通路中的FZD10、TBL1X、CSNK1E、WNT8a、CSNK1A1L、SFRP4基因甲基化水平高于后者，导致Wnt通路活性降低并抑制了成骨细胞分化成熟。β-catenin是Wnt信号通路靶基因，通过建立BMSC成骨分化诱导体系，发现在成骨诱导3天后β-catenin基因表达明显上调，经甲基化特异性PCR法检测发现β-catenin基因甲基化水平明显下降，而β-catenin基因表达增加促进了BMSC向成骨分化。Wu等研究发现，股骨头坏死患者的MSC中Wnt受体Frizzled1基因转录水平较低，同时伴有Frizzled1基因启动子异常高甲基化，这使得Wnt／β-catenin信号通路功能被抑制并直接影响MSC成骨分化及骨形成。另外，在该过程中Wnt信号通路共受体酪氨酸激酶样孤核受体2可通过诱导成骨转录因子Osx改变干细胞分化表型，而其自身表达增加并伴随DNA甲基化水平降低。综上所述，Wnt／β-catenin信号通路相关基因甲基化水平改变，会影响其表达进而对骨形成产生影响。
Notch信号通路广泛存在于哺乳动物细胞内，由5种配体（Delta-like-1，Delta-like-3，Delta-like-4，Jagged-1和Jagged-2）、4种受体（Notch1～4）、下游传导靶基因和调节分子组成，当其受体与配体结合后，Notch受体释放部分胞外片段，胞内部分经γ-促分泌酶（γ-secretase）酶切后释放可溶性的NICD。NICD转移至细胞核内，与转录抑制因子结合后即成为转录活化因子，最终影响细胞的分化、增殖和凋亡。研究表明，Notch信号通路对成骨分化具有抑制和促进的双重作用，且Notch1、Notch4、Delta-like-1等受体或配体受DNA甲基化调控。Notch1可抑制MSC成骨分化，Zhou等在研究中发现，诱导成骨分化14天后，钙化性主动脉瓣疾病和人主动脉瓣间质细胞中Notch1启动子甲基化水平显著升高，导致Notch1表达下调进而促进成骨分化，增加钙化程度，而使用5-氮胞苷处理之后则抑制了成骨分化。另一研究中，Hadji等在钙化性主动脉瓣疾病中观察到长链非编码RNAH19表达增加，且启动子区甲基化降低，进一步分析表明，H19通过阻止P53募集其启动子区进而沉默Notch1，以促进成骨分化。
目前，关于DNA甲基化通过Notch信号通路来调节骨代谢的研究较少。研究表明，Notch1、Notch4基因均存在甲基化，且Delta-like-1基因启动子的超甲基化可调控其表达，当这些配体或受体启动子甲基化水平改变时会激活Notch信号通路，引起下游信号分子HES1上调，进而对骨形成产生影响。此外，Wnt和Notch信号通路并不完全独立，Wnt信号通路中的糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）和Notch信号通路可相互作用，通过结合和磷酸化Notch2来调节Notch的活化。Wnt信号通路在成骨调控中其目的基因的表达依赖Runx2的活性，Notch信号通路目的基因HEY1编码的蛋白质可对抗并降低Runx2的转录活性，进而抑制Wnt目的基因的表达，而当Notch1启动子DNA甲基化水平升高时，会导致其表达降低而使NICD释放减少，进而促进Wnt／β-catenin信号通路激活，促进成骨分化。基于以上分析，作者认为Notch1基因甲基化水平降低时会促进其表达，发挥其对Wnt信号通路的抑制作用，从而抑制成骨分化；当Notch1基因甲基化水平升高时则会抑制其表达，从而对骨形成产生积极作用，另外，LncRNA在其中也发挥一定作用。
3）OPG／RANKL／RANK系统与DNA甲基化
OPG／RANKL／RANK系统是调节骨吸收代谢的关键途径分子轴。成骨细胞分泌的RANKL可以激活破骨细胞上的RANK并与其结合，在肿瘤坏死因子（TNF）受体相关因子参与下激活信号转导，从而促进破骨细胞成熟，增强骨吸收作用，而骨保护素可以抑制RANKL与RANK的结合，降低骨吸收。目前研究表明，TNF受体相关因子参与骨保护素（osteoprotegerin，OPG）／RANKL／RANK系统调节骨代谢的可能途径为：①核转录因子κB途径，首先RANK会与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAP6）结合，激活核转录因子κB诱导激酶并使得核转录因子κB转移至细胞核上调c-fos的表达，使得破骨细胞生成基因开始转录，并诱导破骨细胞成熟；②c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途径，RANK与TRAP6结合后激活ERK、MAPK、JNK，并诱导c-Jun／Fos活化蛋白1（AP-1）活化，使c-Jun磷酸化，c-Fox表达增加，最终使破骨前体细胞功能活跃，分化生成破骨细胞；③蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称为Akt）途径，RANK与TRAP6结合，激活磷脂酰肌醇，活化Akt，参与NF-κB活化，促进破骨细胞成熟。
DNA甲基化可以调控OPG／RANKL／RANK系统影响骨代谢。在对小鼠ST2的BMSC研究中发现，诱导分化的BMSC中RANKL基因转录起始位点周围的CpG出现甲基化，导致启动子沉默，抑制了RANKL基因表达，影响成骨细胞分化。进一步实验表明，仅RANKL基因启动子TATA-box上游的单一CpG位点的甲基化就可调节其表达，进而影响破骨细胞分化。DELGADOCALLE等使用5-氮胞苷处理高甲基化的HEK-293细胞，发现RANKL和骨保护素表达明显上调，而此变化会影响破骨细胞形成，影响骨稳态。另外，DNMT3a能够通过SAM介导的代谢途径，抑制抗破骨细胞形成基因的表达，调节破骨细胞分化，且此代谢过程涉及RANKL通路相关基因甲基化的改变。虽然Husain等曾表示在人体研究中尚未发现骨质疏松症患者组之间RANKL基因的甲基化差异，但Wang等通过分离非骨质疏松／骨质疏松性骨折组织，对骨保护素和RANKL启动子的CpG岛中CpG位点甲基化状态进行检测，结果发现，骨质疏松症组RANKL表达显著高于非骨质疏松症组，而RANKL基因启动子的甲基化水平远低于非骨质疏松症组。以上分析表明，RANKL基因甲基化水平降低会促进其表达，使OPG／RANKL降低并提高破骨细胞活性，促进了骨吸收，导致骨流失加速并产生骨质疏松症。
综上所述，在经典的Wnt／β-catenin、Notch信号通路、OPG／RANKL／RANK系统中，部分受体或配体及下游因子存在DNA甲基化，如β-catenin、Frizzled、Notch1、Jag-1、RANKL以及Runx2、Osx、OPN等众多下游基因，在骨质疏松症体内往往出现甲基化异常，导致骨形成受阻以及骨吸收增加，骨代谢失衡。而除了Wnt／β-catenin与Notch信号通路之间的交互影响外，Notch信号通路中的Notch1也可促进骨保护素表达，进而抑制破骨细胞形成，减少骨吸收。
2.组蛋白修饰对骨形成作用的影响
组蛋白有5种类型，包括H1、H2A、H2B、H3、H4。它们富含带正电荷的碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸），能够与DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用，是一类小分子碱性蛋白质，而且组蛋白是已知蛋白质中最保守的蛋白质。组蛋白化学修饰发生在组蛋白N端尾部，尤其是组蛋白H3和H4的修饰促进染色质结构的变化。组蛋白尾部由20个氨基酸组成，从DNA转弯处的核小体间延伸出来。
真核细胞染色质形成核小体，核小体是多个组蛋白亚单位和DNA的复合体，它保护着DNA和表观遗传信息。组蛋白翻译后修饰是表观遗传调控的关键环节，影响谱系提交和基因表达。可复性的共价组蛋白修饰最常发生在化学结构不稳定的氨基酸残基（如赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和组氨酸）的氨基端和羧基端，也可发生在核小体核的组蛋白反折或球状结构域内。每个修饰后组蛋白残基都承载着特异性信息。例如，H3K4me3甲基化是广泛研究中的组蛋白修饰，它通常提示基因转录处于稳定或活跃状态。信息传递可通过多种机制，包括改变组蛋白间或组蛋白-DNA间的相互作用，募集能够影响组蛋白修饰和重构过程的结合因子。修饰组蛋白甲基化的最常见位点包括赖氨酸：H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79和H4K20；精氨酸（R）：H3R2、H3R8、H3R17、H3R26和H4R3。然而，位于组蛋白H1和核组蛋白H2A、H2B、H3和H4上的几种其他残基，会以不同的方式进行修饰。尽管组蛋白修饰表现各异，以此来提供特定基因的表达信息，但细胞内总的蛋白修饰展现了涉及个体细胞表观遗传状态的复合型组蛋白编码。由于特异性修饰会产生协同或拮抗效果，而且不同核小体或群落中不同细胞的修饰类型不同，因此这种编码信息变得愈加复杂。例如，胚胎干细胞的许多增强子同时有H3K4me3和H3K27me3标志，它们相互拮抗，这些标志分子与转录活化或抑制状态有关。亚单位复合体中含有众多组蛋白修饰酶。修饰后的残基产生出与核小体相锚合的酶所必需的结合位点。例如，指南针样组蛋白修饰复合体能识别、去甲基化H3K27me3（通过UTX作用），同时甲基化H3K4（通过MLL3／4作用），乙酰化H3K9和H4K16（通过WDR5作用）。
相对而言，组蛋白的甲基化修饰方式是最稳定的，因此最适合作为稳定的表观遗传信息。而乙酰化修饰具有较高的动态，另外还有其他不稳定的修饰方式，如磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等。这些修饰更为灵活地影响染色质的结构与功能，通过多种修饰方式的组合发挥其调控功能，所以有人称这些能被专门识别的修饰信息为组蛋白密码。这些组蛋白密码组合变化非常多，因此组蛋白共价修饰可能是更为精细的基因表达方式。另外，研究发现H2B的泛素化可以影响H3K4和H3K79的甲基化，这也提示了各种修饰间也存在着相互的关系。(https://www.daowen.com)
促进骨形成的组蛋白编码或表观遗传活动呈现相对非特异性。最近有学者研究了人类BMSC和MC-3T3-E1前成骨细胞成骨分化中，组蛋白修饰在Runx2蛋白结合活动中的作用。
促进骨形成的基本表观遗传修饰正在研究当中，大量研究致力于明确骨形成过程中组蛋白修饰活动的调控机制。成骨细胞或BMSC模型中甲基转移酶和去甲基化酶功能已经直接获得评估。有学者通过基因敲除／转基因的互补试验，证实精氨酸甲基转移酶PRMT4（arginine methyltransferase PRMT4，CARM1）通过Sox9甲基化在软骨内成骨和软骨细胞增殖中发挥作用。人类Wolf-Hirschhorn综合征是包括颅面缺陷在内的骨发育和生长异常，WHSC1基因最初获得研究是源于它在这种疾病中的作用。WHSC1基因也称为NSD2基因，编码KMT，后者能够甲基化H3K36。在大鼠模型中敲除此基因，会影响Runx2和P300的相互作用，严重影响骨发育。除此之外，NSD1蛋白是H3K36的特异性甲基转移酶，这种酶与Soto综合征有关，这种综合征包括巨头畸形和骨骼加速老化。PRC2相关H3K27甲基转移酶Ezh2（H3K27 methyltransferase Ezh2，KMT6）直接抑制成骨过程，这可能是通过促进脂源性分化或阻断成骨基因表达实现。但中央脊细胞向骨软骨源性前体细胞分化过程，还可能需要Ezh2参与。
有研究评估了去甲基化酶在成骨细胞呈递和分化中的作用。间充质细胞呈递中H3K27去甲基化酶UTX（H3K27 Demethylase UTX，KDM6A）高表达，使该细胞骨源性分化超过脂源性分化。Jmjd3（KDM6B）或Jmjd2B（KDM4B）表达降低，会分别增加H3K27或H3K9甲基化水平，进而抑制成骨分化，降低成骨基因表达。组蛋白去甲基化酶NO66使H3K4和H3K36去甲基化，调控包括Osx在内的成骨基因表达，抑制成骨分化。
成骨相关信号分子也能诱导表观遗传修饰。Wnt5a诱导BMSC中组蛋白甲基转移酶的磷酸化。SETDB1（KMT1E）利于组蛋白H3K9甲基化，抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达和脂源性分化，利于成骨分化。
已经证实乙酰转移酶在成骨分化或骨形成中具有重要作用。CREB结合蛋白（CBP／KAT3A）是非特异性组蛋白乙酰转移酶，编码它的基因产生突变会导致Rubinstein-Taybi综合征，这是一种使脸部和肢体发育异常的常染色体显性遗传疾病。CBP使组蛋白残基乙酰化，促进成骨过程中骨相关基因增强子的乙酰化和活化，是骨相关基因表达的直接或共调控因子。还有几种乙酰转移酶在骨形成、成骨细胞相关基因表达或下调骨性关节炎等表观遗传调控方面发挥作用，包括PCAF（KAT2B）、MOZ／MORF（KAT6A／KAT6B）和具有昼夜节奏规律的特异性乙酰转移酶Clock（specific acetyltransferase，KAT13D）。
在骨科领域，研究最多的组蛋白修饰酶是组蛋白去乙酰化酶。有研究已经明确特异性组蛋白去乙酰化酶能够调控骨相关基因，影响成骨细胞分化功能。另外，组蛋白去乙酰化酶也能调控细胞外信号通路，在微环境中影响骨源性呈递和分化。
正如许多乙酰转移酶一样，组蛋白去乙酰化酶功能具有多样性、复杂性，它可作用于非组蛋白上的乙酰化赖氨酸。许多组蛋白去乙酰化酶能使多种蛋白去乙酰化，包括骨形成相关转录因子Runx2，它能通过去除Runx2蛋白乙酰基或直接通过物理作用调控其功能。因为大多数组蛋白去乙酰化酶蛋白本身不具有染色质结合能力，它们常作为染色质的转录共抑制因子出现。特异性组蛋白去乙酰化酶常与几种骨相关转录调控因子组成复合体，在微环境中调控成骨细胞相关基因表达，包括Runx2、NFATc1、锌指蛋白521（Zinc finger protein 521，Zfp521）和PBX1。Runx2转录蛋白与DNA链直接结合，调控DNA链中ALP、Ⅰ型胶原、OCN等目的基因的成骨表达，在成骨发育中具有不可替代的作用。组蛋白去乙酰化酶6结合于Runx2蛋白的羧基端，构成组蛋白去乙酰化酶6／Runx2转录复合体，能够调控Runx2蛋白的促成骨活性。组蛋白去乙酰化酶不仅与成骨细胞成骨过程直接相关，还与骨性关节炎疾病有密切关系。
3.非编码RNA对骨形成作用的影响
非编码单链RNA（non-coding single-stranded RNA，miRNA）是非编码单链RNA，是长度为20～25 bp的高度保守的小分子RNA，广泛存在于真核生物中。miRNA在进化上具有高度的保守性，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。尽管miRNA基因不编码蛋白质，但其编码的RNA在生物的整个生命过程中发挥着重要作用。并且在各类小分子RNA中，miRNA具有最广泛的基因调节功能。
miRNA的生成必须通过Dicer酶（双链RNA专一的RNA内切酶）对从折叠的发夹状转录前体的一条臂上切割得来。体外实验发现，破骨细胞特异性Dicer酶的缺失可抑制破骨细胞介导的骨吸收过程，提示miRNA在破骨细胞生成及骨吸收过程中发挥了正性调控作用。
干细胞的成骨分化是骨形成的前提，受多种转录因子和信号通路的调控。转录因子如Runx2、Osx和Smad家族成员蛋白（Smad family proteins，Smads）等与成骨分化密切相关。其中，Runx2作为成骨早期阶段负责成骨分化的关键转录因子，参与了BMP、转化生长因子β和Wnt／β-catenin等多条通路介导的成骨分化过程。同样，Smads可以通过参与转化生长因子β（TGF-β）和BMP信号通路调控成骨分化过程。而Osx作为Runx2下游的一个重要转录因子，受Runx2的调控，影响成骨细胞的成熟。
信号通路如Wnt／β-catenin、BMP、转化生长因子和MAPK等参与成骨分化信号转导，其中Wnt／β-catenin信号通路是成骨分化中的一条重要信号通路，主要是胞外Wnt蛋白与膜蛋白受体结合，形成二聚体促使β-catenin在胞内积累，而后β-catenin进入细胞核与T细胞转录因子、淋巴增强因子结合形成复合体，激活下游Runx2和Osx等转录因子，进而发挥对成骨分化的调控作用。而BMP介导的成骨分化途径为：首先BMP与跨膜受体结合，随后通过Smad或MAPK信号通路传递信号，磷酸化Runx2和Osx等下游转录因子而调控成骨分化过程。MAPK信号通路可以通过保守的三级酶促级联反应激活特定转录因子，从而调控相关基因表达，进而在干细胞成骨分化过程中发挥重要的作用，其中研究最广泛的3条通路为ERK、c-Jun氨基末端激酶和p38MAPK。
近年来，涉及骨相关疾病的非编码RNA的分子机制已被大量研究，越来越多的研究表明，非编码RNA是维持骨稳态的重要调控因子，其在干细胞分化中发挥关键作用。已证实许多非编码RNA是参与调节复杂的成骨分化过程中的信号转导网络节点，其用作骨组织工程生物活性因子的研究也日益深入。
miRNA：研究表明越来越多的miRNA通过调控其靶基因的表达，影响各信号通路上游或下游调控因子的表达水平，进而影响成骨分化过程。Runx2受到许多miRNA的直接或间接调控，包括miR-221、miR-467g、miRNA-133a-5p等。Osx的表达可被一些miRNA下调，进而抑制成骨分化过程，如miR-145和miR-143等。
另外，miRNA的差异性表达对成骨分化相关信号通路起着重要的调控作用。Dickkopf相关蛋白1（Dickkopf，DKK1）和frizzled相关蛋白1（secreted frizzled-related protein-1，SFRP1）是WNT信号通路典型的强效拮抗因子，miR-433-3p和miR-542-3p分别通过靶向下调DKK1和SFRP1的表达水平，增强Wnt／β-catenin信号通路的传导，从而促进成骨分化。ACVR1（激活素A受体）是BMP信号通路中的重要调控因子，负责骨髓系统的发育和修复，miR-208a-3p过表达将降低ACVR1的翻译水平，从而下调BMP-2及其下游靶标Smad1／5和Smad4的表达，使骨形成受到抑制。此外，转化生长因子β信号通路对Smad蛋白（Smad2、Smad3）有关键的调控作用。研究发现miR-140可靶向结合Smad3进而抑制转化生长因子β信号通路，而转化生长因子β信号通路也可抑制miR-140的积累，表明miR-140／Smad3／转化生长因子β信号通路3者以负反馈形式调节BMSC的成骨分化。
LncRNA已被证实可以通过表观遗传修饰与miRNA相互作用，以及与转录因子结合等方式参与调控成骨分化。表观遗传水平调控成骨分化的研究主要集中在组蛋白修饰方面，包括组蛋白的甲基化、乙酰化和泛素化等。哺乳动物的LncRNA中大约有20%可结合多梳抑制复合物2，EZH2是多梳抑制复合物2的核心亚基，可通过诱发组蛋白H3K27的甲基化来抑制基因转录。研究发现LncRNA-Hox A-AS3和LncRNA ANCR均可与EZH2结合引发组蛋白H3K27的甲基化，使Runx2表达降低，进而抑制人MSC的成骨分化能力。
另外，LncRNA-miRNA-mRNA调节模式在成骨分化中起着关键作用，即LncRNA可作为miRNA的竞争性内源RNA竞争miRNA的结合位点，从而减弱其对mRNA的直接影响。LncRNA MALAT1可竞争性地与miR-30结合，抑制miR-30与Runx2的3′UTR相互作用，进而上调Runx2的转录水平，促进脂肪MSC成骨分化。研究发现LncRNA TUG1、LncRNA PCAT1、LncRNA HIF1A-AS2同样是通过吸附miRNA的方式来间接调节成骨相关信号分子的活性，进而调控成骨分化。
LncRNA也可直接与转录因子结合形成LncRNA-蛋白质复合物，且通过调节转录因子的表达水平在成骨分化中发挥作用。p38是MAPK通路的主要调控因子之一，LncRNA DANCR通过下调p38表达水平，致使p38-MAPK信号通路的失活，进而抑制人BMSCs的增殖和成骨分化。另一种LncRNA MEG3则从BMP-4启动子解离转录因子SOX2以增加BMP-4基因的表达，证实MEG3过表达可通过靶向BMP-4的转录促进多发性骨髓瘤中MSC的成骨分化。