运动对T2DM小鼠骨中TGF-β／BMP途径及骨形成代谢作用的影响
患T2DM后机体内形成高血糖和低胰岛素浓度状态，对骨代谢产生了重要的负向调控作用（抑制骨形成代谢并增强骨吸收代谢），导致骨质疏松以及骨折的发生。运动训练作为一种特殊的干预方式，对于骨重建和骨构塑具有重要的作用。研究证实，骨组织形态结构、骨密度和骨小梁的形态结构及其三维立体结构与运动训练对其产生的力学刺激存在密切的关系。因运动训练是一种经济、有效且无不良反应可以改善T2DM骨质疏松状况的有效方式，目前已被广大患者所接受。体育领域内有关运动训练影响T2DM骨代谢的研究还不是很多，主要集中在人体和动物研究上。但是相关研究仅局限在运动训练影响骨量、骨密度、骨生物力学、血液生化指标等的一些较为简单指标检测上，对于运动训练影响T2DM骨形成代谢的生物学机制尚不清晰。本章第二节中的研究发现，T2DM小鼠骨组织中GPR48表达显著下调，从而使得其下游的TGF-β／BMP的信号通路也受到显著抑制，成骨细胞分化及成骨能力显著下降，小鼠骨组织形态计量学相关指标和骨密度显著下降。说明GPR48在T2DM小鼠骨代谢过程中起着重要的调控作用。本节将利用下坡跑和游泳两种运动方式对T2DM小鼠（高脂膳食加注射STZ的方法进行造模）进行为期8周的训练，训练结束后对小鼠进行取材并利用石蜡切片、ALP染色、RT-PCR、Western-blotting、成骨细胞原代培养等方法，探究不同方式运动影响T2DM骨形成代谢的生物学机制。
1.材料与方法
实验动物及其造模和训练，主要试剂、仪器、试剂配制方法，以及实验动物取材和相关指标检测均同第三章第二节。
2.实验结果
1）不同方式运动对T2DM小鼠骨组织中GPR48表达的影响
由图4-9和表4-6可知，与TC组相比，TS组GPR48 mRNA和蛋白表达均显著上调（P＜0.01，P＜0.05），TD组GPR48 mRNA和蛋白表达亦显著上调（P＜0.01）；与TS组相比，TD组GPR48蛋白表达显著上调（P＜0.05）。
图4-9 不同运动组T2DM小鼠骨中GPR48蛋白表达条带图
注：GPR48为G蛋白偶联受体48；β actin为β-肌动蛋白。
表4-6 不同运动组T2DM小鼠骨中GPR48表达的比较（
）
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05。
2）不同方式运动对T2DM小鼠骨中TGF-β／BMPs信号通路中相关细胞因子mRNA表达的影响
分析表4-7可知，与TC组相比，TS组小鼠骨组织中TGF-β1、BMP-9、Smad5、OC、Osx、OCN、ALP和Col1的mRNA表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01），但BMP-4、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、BMP-2、Smad8、BSP、Runx2和OPN的mRNA表达均呈上调趋势但差异不具有显著性（P＞0.05）；TD组小鼠骨组织中TGF-β1、Smad2、BMP-2、BMP-9、Smad1、Smad5、Runx2、OC、Osx、OCN、ALP、Col1和OPN的mRNA表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01），而BMP-4、Smad3、Smad4、Smad8、BSP的mRNA表达均呈上调趋势但差异不具有显著性（P＞0.05）。与TS组相比，TD组小鼠骨组织中Smad2、BMP-4、Smad8、OC、Osx、ALP、Col1的mRNA表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01），而TGF-β1、Smad3、Smad4、BMP-2、BMP-9、Smad1、Smad5、Runx2、OCN、BSP和OPN的mRNA表达均呈上调趋势但差异不具有显著性（P＞0.05）。
表4-7 不同运动组T2DM小鼠骨中细胞因子mRNA表达的比较（
）
续 表
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TC组相比，“△”表示P＜0.05，“△△”表示P＜0.01。
3）不同方式运动对T2DM小鼠骨中TGF-β／BMP信号通路中相关细胞因子蛋白表达的影响
由图4-10所示和分析表4-8可知，与TC组相比，TS组p-Smad1、Smad5、p-Smad8、p-Smad2、p-Smad3和OPN的蛋白表达均出现显著变化（P＜0.05或P＜0.01），而Smad1、Smad4和Col1的蛋白表达虽都有变化但差异不具有显著性（P＞0.05）；TD组Smad1、Smad5、p-Smad8、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad1、Smad4和Col1的蛋白表达均出现显著变化（P＜0.05或P＜0.01），而OPN蛋白表达虽上调趋势但差异不具有显著性（P＞0.05）。与TS组相比，TD组p-Smad1、p-Smad8、p-Smad2、p-Smad3、Smad4和Col1的蛋白表达均出现显著变化（P＜0.05），Smad1、Smad5和OPN的蛋白表达虽都有变化但差异不具有显著性（P＞0.05）。
表4-8 不同运动组T2DM小鼠骨形成细胞因子蛋白表达的比较（
）
续 表
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
图4-10 不同运动组T2DM小鼠骨形成细胞因子蛋白表达条带
注：Samd为Smad蛋白；p-Smad为磷酸化Smad蛋白；β-actin为β-肌动蛋白；GAPDH为磷酸甘油醛脱氢酶；p-Samd为p-Samd蛋白；Col1为Ⅰ型胶原蛋白；OPN为骨桥蛋白。
4）不同方式运动对诱导分化产生的成骨细胞中相关细胞因子mRNA表达的影响
分析表4-9可知，取不同组的成骨细胞并利用RT-PCR技术对成骨细胞中相关细胞因子mRNA表达情况进行检测，发现与TC组相比，TS组成骨细胞中GPR48、Osx、ALP和DMP1的mRNA表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01），而Runx2、PHEX和SOST的mRNA表达无显著变化（P＞0.05）；TD组成骨细胞中GPR48、Osx、ALP和DMP1的mRNA表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01），而Runx2、PHEX和SOST的mRNA表达无显著变化（P＞0.05）；与TS组相比，TD组成骨细胞中ALP的mRNA表达显著上调（P＜0.05），而GPR48、Runx2、Osx、SOST、DMP1和PHEX的mRNA表达均上调但差异不具有显著性（P＞0.05）。
表4-9 不同运动组成骨细胞中细胞因子mRNA表达的比较（
）
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05。
5）不同方式的运动对T2DM小鼠成骨细胞分化及成骨能力的影响 (https://www.daowen.com)
由图4-11（彩图见附录）所示可知，T2DM小鼠经过8周下坡跑和游泳运动干预后，取BMSC进行原代培养并利用Vc和β甘油磷酸诱导其向成骨细胞分化，利用ALP、茜素红和AgNO3染液分别对小鼠成骨细胞进行染色，结果发现与TC组相比，TS组的ALP、茜素红和Von Kossa染色结果显著好，TD组ALP、茜素红和Von Kossa染色结果显著要好。与TS在相比，TD组成骨细胞的ALP和Von Kossa染色结果都显著升高，而茜素红染色结果却都差异不大。说明运动训练可显著提高成骨细胞分化及骨形成能力，其中以下坡跑效果更佳。
6）不同方式运动对T2DM小鼠BMSC向脂肪细胞分化的影响
由图4-12（彩图见附录）所示可知，T2DM小鼠经过8周下坡跑和游泳运动干预后，取BMSCs进行原代培养并诱导其向脂肪细胞分化，利用油红O染液对脂肪细胞进行染色，结果发现与TC组相比，TS组的脂肪细胞数量显著减少，TD组脂肪细胞亦显著减少；与TS组相比，TD组脂肪细胞显著减少。说明运动训练可抑制BMSCs向脂肪细胞分化，其中以下坡跑抑制作用更佳。
图4-11 不同运动组T2DM小鼠分化产生的成骨细胞活性和成骨能力
图4-12 不同运动组T2DM小鼠分化产生的脂肪细胞（×10）
7）不同方式运动对T2DM小鼠骨形成能力的影响
图4-13 不同运动组T2DM小鼠颅骨茜素红染色结果
图4-14 不同运动组T2DM小鼠颅骨ALP染色结果
由图4-13和图4-14（彩图见附录）可知，T2DM小鼠经过8周下坡跑和游泳训练后，取小鼠颅骨利用茜素红和ALP染液对其进行染色，发现与TC组相比，TS组和TD组小鼠的骨形成能力显著增强（染色越深，说明骨形成能力越强）。而TS组和TD组之间的茜素红染色结果差异不是很显著，TD组ALP染色结果显著优于TS组。
3.讨论分析
1）不同方式运动对T2DM小鼠骨中GPR48和TGF-β／BMP信号通路相关细胞因子表达的影响
骨组织在代谢过程中受到很多因素的影响，如激素水平、外部力学刺激、细胞因子表达、各信号通路等。近年研究证实，各细胞因子（如GPR48等）和信号通路（如TGF-β／BMP信号通路、Wnt信号通路），包括经典和非经典两条通路、Hedgehog信号通路和Notch信号通路等在骨形成代谢过程中起着关键的调控作用。GPR48与其他糖蛋白激素受体如卵泡刺激素受体、甲状腺刺激素、黄体生成素受体等具有同源结构。GPR48可通过G蛋白解偶联介导细胞内相关酶和离子通道从而发挥其生物学作用。研究发现，GPR48在骨形成代谢中亦扮演着重要角色。本研究也发现，GPR48表达下调使得小鼠骨量和骨组织形态计量学等相关指标显著下降。综上所述，表明GPR48在调控骨组织代谢上具有重要的作用，当其基因缺失或被抑制时，骨形成代谢显著降低。
TGF-β／BMP在BMSCs向成骨细胞分化和骨基质形成过程中均起着重要的调节作用。TGF-β／BMP信号通路可显著提高成骨细胞的骨基质蛋白（如Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、OPN、骨涎蛋白等）的形成能力，以上基质蛋白在骨中沉积后可为无机矿物质（钙、磷等）在骨中沉积提供有利的条件。这些基质蛋白还在骨组织矿化和骨基质成熟过程中具有重要的作用。TGF-β信号通路可通过磷酸化其下游的Co-Smads（即Smad2／3，这两个Smad结构相似，具有高度同源性），进而转移入核调控其下游靶基因表达以影响成骨细胞的分化产生及骨形成能力。虽然Smad2和Smad3具有高度同源性，但是Smad2和Smad3在TGF-β信号通路中所起的调节作用上存在较大的差异。Smad3可与DNA直接结合调节胚胎发育，而Smad2是通过间接的方式调节出生后的骨生长发育。Smad2和Smad3在功能上的差异可能与以下因素有关：这两个Smad可通过非依赖性通路来介导TGF-β的不同生物学作用；活化的细胞中Smad3被激活且在静息细胞中Smad2发生核转位，这种细胞活化和静息状态的交替导致信号通路的转换，也形成了对TGF-β信号通路的选择性；Smad2和Smad3可能通过不同的Smads信号复合物形成来选择性调节TGF-β依赖的特异基因表达。当TGF-β被激活后可通过Smad2／3／4形成一个复合体并转移入核，直接和Jun-b、Jun-c和Jun-d蛋白的表达产物AP-1结合，从而调控ALP、Col1、Runx2等以调控成骨细胞分化和成骨能力靶基因表达，促进骨形成代谢。
BMPs是一类多功能的细胞生长因子，具有广泛而多样的生物学效应。在BMPs介导的信号通路中，Smads可将胞外的信号转导入核内。在细胞核内，各种Smads结合蛋白通过不同的机制与Smads转录复合物相互作用，促进或抑制BMPs相关基因的转录。Runx2（也称为Cbfa1），能特异地识别并结合成骨细胞特异性顺式作用元件2（OSE2），以调节靶基因的表达。BMPs可通过磷酸化Smad1／5／8并使其形成一个磷酸基团，激活下游靶基因OCN、Ⅰ型胶原蛋白、BSP和OPN等蛋白表达，共同调节骨形成。
目前，有关GPR48通过TGF-β／BMP信号通路调控骨组织形成代谢的研究还鲜有报道。但在生物学研究中，发现GPR48可通过TGF-β／BMP信号通路调控很多生物学过程（如骨骼肌分化产生、多囊性肾病等）。研究发现，LGR4（即GPR48）通过激活TGF-β／Smads和BMPs／Smads信号通路来调控骨骼肌细胞的代谢。以上研究表明，GPR48与TGF-β／BMP信号通路之间存在着密切的调控关系。目前有关TGF-β／BMP信号通路调控骨形成代谢的相关研究较多。如激活TGF-β／Smad信号通路可提高成骨细胞分化及其矿化能力，促进骨形成代谢；激活BMP／TGF-β信号通路可显著提高ALP活性，并促进促进骨形成代谢。根据以上研究，GPR48通过调控BMP／TGF-β信号通路中相关细胞因子表达进而发挥其生物学调控作用，并且BMP／TGF-β信号通路中相关细胞因子表达可显著促进成骨细胞分化和骨形成代谢。笔者据此推测，GPR48可通过激活TGF-β／BMP信号通路，上调相关细胞因子表达以促进成骨细胞分化和骨形成代谢。但是生物领域内有关GPR48通过TGF-β／BMPs信号通路调控T2DM骨形成代谢的相关研究尚未见报道。但是，本研究发现GPR48表达下调会通过抑制TGF-β／BMP信号通路，使得分化产生的成骨细胞减少且成骨能力降低，骨量和骨组织形态结构都显著下降。研究证实，运动训练可显著促进T2DM小鼠的骨形成代谢。体育领域内有关通过运动训练调控TGF-β／BMPs信号通路进而影响骨形成代谢的相关研究较多，但有关通过运动训练上调GPR48以调控TGF-β／BMPs信号通路，进而影响T2DM骨形成代谢的相关研究未见报道。
本研究中，经过8周游泳和下坡跑训练后，与TC组相比，TS组小鼠骨组织中GPR48表达显著上调，而TD组小鼠骨组织中GPR48表达也显著上调。说明游泳和下坡跑两种运动方式均能显著激活T2DM小鼠骨组织中GPR48表达。运动训练可显著激活GPR48表达，这与运动训练对T2DM小鼠骨组织产生的力学刺激有关。力学刺激可显著促进小鼠机体内胰岛素分泌，使得胰岛素浓度升高，从而上调小鼠骨组织中GPR48表达。也可能与运动训练可上调T2DM小鼠骨组织中Rspo1表达有关，因为Rspo1是GPR48的配体，其表达上调可显著激活GPR48的表达。与TS组相比，TD组GPR48表达显著上调，说明与游泳组相比，下坡跑可显著上调T2DM小鼠骨中GPR48表达。这可能与下坡跑对T2DM小鼠骨组织造成的地面反作用力（即直接作用力）强度较大有关，较大强度的直接作用力可显著促进小鼠胰岛素分泌和上调Rspo1的表达，从而使得小鼠骨中GPR48表达显著上调。
在本研究中，与TC组相比，TS组和TD组T2DM小鼠骨中TGF-β／BMP信号通路的相关细胞因子表达均出现显著上调，说明游泳和下坡跑可显著激活TGF-β／BMP信号通路中细胞因子的表达。同时，还发现激活TGF-β／BMP信号通路可能与运动训练可上调小鼠骨中IGF-1表达有关。血液中的IGF-1与骨组织中的GPR48表达存在密切的调控关系，当IGF-1表达变化时可通过GPR48进而调控成骨细胞分化及成骨能力，促进骨形成。由于目前体育领域内有关运动训练调控T2DM骨代谢的相关研究较少，相关生物学机制尚不明确，还存在很多的未知。
2）不同方式运动对T2DM小鼠诱导分化产生的成骨细胞中相关细胞因子mRNA表达的影响
成骨细胞的分化和生长过程主要分为增殖、细胞外基质成熟、矿化及细胞凋亡等4个过程。而成骨细胞分化和生长的每个阶段都受到不同细胞因子的调控，如GPR48、Runx2、Osx、DMP1、SOST等。目前，国内外有关以上细胞因子调控T2DM机体的成骨细胞分化的相关研究较少。研究中发现，T2DM抑制成骨细胞分化产生，并导致骨质疏松的发生，而在分化产生的成骨细胞中Runx2、DMP1、SOST和PHEX等促分化因子表达均出现显著下调。运动训练可显著改善T2DM小鼠的骨代谢状况，而目前体育领域内有关运动训练影响T2DM小鼠分化产生的成骨细胞中各种调控因子表达的相关研究尚鲜有报道。
本研究中，经过8周训练后，取小鼠BMSCs并诱导其向成骨细胞分化，然后取成骨细胞利用RT-PCR技术检测各调控细胞因子在成骨细胞中的表达发现，与TC组相比，TS组GPR48、Runx2、Osx、ALP、DMP1、PHEX和SOST的mRNA表达均显著上调。TD组GPR48、Runx2、Osx、ALP、DMP1、PHEX和SOST的mRNA表达均显著上调。说明游泳和下坡跑可显著上调分化产生的成骨细胞中各骨形成调控因子的表达。这与本章中游泳和下坡跑可显著促进成骨细胞分化及成骨能力存在密切关系。这可能与游泳和下坡跑训练可显著激活BMP／Smad、Hedgehog信号通路以及Wnt信号通路有关。研究证实，激活以上三条信号通路均可显著上调其下游的靶基因，如Runx2、Osx、ALP、DMP1、PHEX和SOST等，从而促进成骨细胞分化。而GPR48可将成骨细胞受到的外在力学刺激转入膜内，从而激活上述三条信号通路。与TS组相比，TD组小鼠成骨细胞中的GPR48、ALP、DMP1和PHEX的mRNA表达均显著上调，而Runx2、Osx和SOST的mRNA表达都不具有显著性。说明与游泳运动相比，下坡跑上调诱导分化产生的成骨细胞中相关细胞因子表达的作用效果不是很显著。这可能与BMSCs从T2DM小鼠骨髓腔中取出后又进行原代培养，不同运动方式对成骨细胞造成的差异在这个过程中受到外界因素的影响而被淡化了。
3）不同运动方式对T2DM小鼠成骨细胞和脂肪细胞分化及功能的影响
BMSCs可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞及其他类型的细胞。而成骨细胞是骨中最为重要的细胞之一，其主导着骨形成代谢中的膜内成骨过程，当分化产生的成骨细胞数量增多且成骨能力增强时，骨形成代谢就加快，骨量和骨密度也都显著增加。T2DM是一种代谢性疾病，胰岛素的分泌减少会显著抑制骨代谢，而长时间患病后会导致BMSCs定向分化产生的成骨细胞数量减少，且成骨能力显著降低。目前，生物学领域内有关T2DM影响成骨细胞分化的相关研究不是很多，当研究11βHSD1对T2DM小鼠骨质疏松的影响时，发现T2DM使得小鼠BMSC分化产生的成骨细胞及成骨能力均显著下降，而分化产生的脂肪细胞则增多。另有研究也证实，KK／Upj-Ay／J小鼠（自发性T2DM小鼠）分化产生的成骨细胞活性及成骨能力都显著下降。以上研究说明，T2DM可显著抑制机体内成骨细胞的分化、增殖及其成骨能力。而目前生物学研究中用于提高T2DM的成骨细胞分化及其成骨能力的主要是一些药物，如罗格列酮、二甲双胍以及含有各种细胞因子的药物等，这些药物在改善T2DM症状的同时，也会对机体产生不良反应，甚至有的药物会抑制成骨细胞分化。而运动训练作为一种经济、有效且无不良反应的干预方式，在防治T2DM以及改善骨代谢中的作用已被研究所证实。而目前体育领域内有关运动调控T2DM成骨细胞分化及成骨功能的相关研究尚未见报道。
本研究中，采用游泳和下坡跑两种不同方式的运动对T2DM小鼠进行8周运动干预，结束后取小鼠BMSCs进行原代培养并诱导其向成骨细胞分化，利用ALP、茜素红等染色方法对成骨细胞ALP活性及成骨能力进行检测，结果发现，与TC组相比，TS组和TD组的ALP、茜素红和Von Kossa染色结果均显著提高。说明运动训练可显著促进T2DM小鼠的成骨细胞分化产生，并提高其成骨能力，这可能与运动训练激活IGFs和BMP-2等细胞因子表达有关。IGFs表达上调可显著促进T2DM小鼠分化产生的成骨细胞数量增加并提高其骨形成能力。成骨细胞分化相关基因BMP-2的表达可显著促进模拟T2DM机体环境下（高糖和低胰岛素）MC3T3向成骨细胞的分化。这也可能与运动训练可激活T2DM小鼠成骨细胞中Runx2及下游靶基因Osx表达有关，因为Runx2及下游靶基因Osx表达可显著促进T2DM小鼠的BMSC向成骨细胞分化，并提高成骨细胞活性，使得ALP活性显著增强。运动训练促进T2DM小鼠成骨细胞分化，提高成骨细胞骨形成能力与脂肪细胞分化减少亦密切相关，脂肪细胞分泌的游离脂肪酸（FFA）减少时，会通过FFAs-ROS-ERK／P38信号通路上调Runx2、Col A1和OCN等的表达，促进成骨细胞的分化、增殖和成骨能力。以上研究结果也对本章中游泳和下坡跑影响T2DM小鼠颅骨茜素红和ALP染色结果做出解释，说明运动训练对小鼠颅骨茜素红和ALP染色结果的影响与分化产生的成骨细胞数量增加及其成骨能力增强密切相关。而与TS组相比，TD组茜素红染色结果变化不明显而ALP染色显著增强，说明与游泳运动相比，下坡跑可显著促进T2DM小鼠分化产生的成骨细胞活性。与游泳相比，下坡跑对T2DM小鼠骨产生的直接作用力（强度较大）可显著促进成骨细胞分化及其成骨能力。提示下坡跑可显著提高T2DM小鼠颅骨ALP的活性。这是因为成骨细胞活性增强使得合成分泌的ALP显著增多，反映在小鼠颅骨上则表现为ALP活性显著增强。
BMSCs可分化成骨细胞和脂肪细胞，小鼠骨髓腔内的BMSCs数量是一定的，其分化产生的脂肪细胞增多则使得分化产生的成骨细胞数量减少，而抑制骨形成代谢。T2DM在抑制成骨细胞分化的同时也会促进其向脂肪细胞分化，Devlin取T2DM造模成功8周后的雄性TALLYHO／JngJ小鼠BMSC进行原代培养，并诱导其分别向成骨细胞和脂肪细胞分化时发现，T2DM使得小鼠BMSCs分化产生的成骨细胞显著减少而脂肪细胞却显著增多，这与T2DM小鼠骨痂中PPARγ表达上调从而使得MSC分化产生的脂肪细胞增多有关。综上所述，说明T2DM骨质疏松以及骨折恢复延迟等与分化产生的脂肪细胞增多且成骨细胞减少存在密切关系。而运动训练作为一种可显著改善T2DM骨代谢的有效方式，但是有关运动训练调控T2DM MSCs向脂肪细胞分化的相关研究尚鲜有报道。
本研究中，经过8周训练后，TS组和TD组小鼠BMSCs分化产生的脂肪细胞显著减少，说明游泳和下坡跑可显著抑制T2DM小鼠BMSCs向脂肪细胞的分化。这与运动训练可激活PI3K／Akt／GLUT4信号通路有关，也可能与骨中TGF-β／BMPs信号通路表达上调有关。作者前面的研究也发现，激活TGFβ／BMPs信号通路后会显著抑制BMSCs向脂肪细胞分化。运动抑制脂肪细胞分化与促进向成骨细胞分化密切相关，当成骨细胞分化、增殖和成骨细胞成骨能力显著增强时Runx1表达也会显著上调，Runx1表达上调后会抑制脂肪细胞中C／EBPα转录表达，从而抑制脂肪细胞分化产生。而与TS组相比，TD组的脂肪细胞数量显著更少。说明与游泳运动相比，下坡跑能更显著地抑制脂肪细胞分化产生，这与下坡跑对小鼠骨组织产生较大运动强度的直接力学刺激存在密切关系。本研究发现，下坡跑更显著地激活骨组织中的TGF-β／BMPs、PI3K／AKT／GLUT4、Runx1等信号通路或者细胞因子，从而抑制脂肪细胞分化产生，这也与下坡跑能更好地促进成骨细胞分化、增殖和成骨能力有关。综上所述，运动训练可显著促进BMSCs向成骨细胞分化并抑制其向脂肪细胞分化，且下坡跑运动的作用效果优于游泳运动。
4）不同方式运动对T2DM小鼠骨形成能力的影响
骨形成能力主要是指由成骨细胞主导的膜内成骨，当骨形成能力较强时，成骨细胞合成分泌的有机质显著增多，为钙、磷等矿物质沉积提供了有利条件，从而使得骨量显著增加。ALP是目前评价骨形成能力的最重要生化标志物之一，当骨形成能力增强的同时由成骨细胞分泌产生的ALP酶也会增多。而骨茜素红染色是检测骨形成能力的另一种重要方法，茜素红染液可与胞质中的钙离子以螯合的方式形成红色复合物，颜色越深表明骨中钙离子等矿物质含量越高，骨形成能力越强。研究证实，当患T2DM后，机体内胰岛素分泌减少并且血糖处于较高状态，造成内环境紊乱。内环境紊乱（尤其是胰岛素浓度降低）在抑制骨形成代谢的同时也会激活骨吸收代谢，导致骨质疏松甚至骨折发生。T2DM会显著抑制骨形成能力，这在很多研究中已被证实，徐飞在其研究中发现，自发性T2DM雄性KK／Upj-Ay／J小鼠骨形成能力显著下降，血清ALP活性显著下降。Devlin等在研究糖尿病对TALLYHO／JngJ小鼠骨代谢影响时发现，T2DM会显著抑制小鼠的骨形成能力。在第三章中也发现，T2DM会显著抑制小鼠颅骨ALP染色和茜素红染色结果，使得骨形成能力显著下降。而运动训练作为一种有效的促进骨代谢的干预方式，在提高T2DM骨形成能力上亦具有重要的作用。高海宁等发现，在糖尿病发病的整个阶段，游泳干预可显著促进T2DM大鼠的骨形成代谢。目前在体育领域内，有关利用下坡跑和游泳来对T2DM小鼠进行训练并检测小鼠骨形成能力变化的研究鲜有报道。
本研究中，经过8周运动训练后，与TC组相比，TS组和TD组T2DM小鼠茜素红和ALP染色均显著增强，说明8周游泳和下坡跑运动均可增强T2DM小鼠的骨形成能力，这与高海宁等的研究结果相一致。这与游泳和下坡跑能激活BMP-2／Smad信号通路进而使得T2DM小鼠分化产生的成骨细胞数量增多且成骨能力增强有关；也可能与游泳和下坡跑激活T2DM小鼠骨组织中TGF-β／BMP信号通路有关。多项研究发现，运动训练可显著激活T2DM小鼠骨组织中的TGF-β／BMP信号通路，激活TGF-β／BMP信号通路可显著提高T2DM小鼠骨形成能力。由于目前有关游泳和下坡跑通过TGF-β／BMP信号通路调控T2DM小鼠骨形成能力的相关研究尚未见报道，以上均是间接的原因分析，缺少直接的实验证据。与TS组相比，TD组茜素红结果虽然增强但差异并不显著，而ALP染色结果却显著增强。说明与游泳相比，下坡跑可显著提高T2DM小鼠骨形成能力。下坡跑对T2DM小鼠骨产生的力学刺激较大，较大强度力学刺激的健骨作用强于强度较小的力学刺激。还可能与这两种运动方式对骨产生的力学刺激方式不同有关，下坡跑对T2DM小鼠骨造成的直接力学刺激（即地面反作用力）促进骨形成代谢的作用效果显著优于游泳运动的间接作用力（即肌肉杠杆作用力）。综上所述，运动训练可显著提高T2DM小鼠骨形成能力，且下坡跑的作用效果优于游泳。
4.结论
（1）运动训练可显著改善T2DM小鼠的骨形成代谢，其生物学机制可能是运动可通过激活T2DM小鼠骨组织中GPR48和TGF-β／BMP信号通路及其下游相关靶基因表达，从而促进成骨细胞分化及其成骨能力并抑制脂肪细胞分化，提高T2DM小鼠的骨形成能力。
（2）下坡跑运动提高T2DM小鼠骨形成代谢的作用效果优于游泳运动。