一、材料与方法
1.实验动物
40只4周龄C57BL／6雄性小鼠［购自上海西普尔—必凯公司［生产许可证号：SYXX（沪）2015-0011］，初始体重19 g，适应性饲养1周后，随机分为正常对照组和T2DM组各20只，T2DM组小鼠要先进行T2DM造模，然后再随机分组。用标准饲料和高脂饲料（购自斯莱克公司）喂养小鼠，自由饮水，昼夜比为1∶1（24 h／d）。小鼠在华东师范大学体育与健康学院清洁级动物房进行饲养。以上实验均通过华东师范大学动物实验伦理委员会批准（伦理编号：M20150311）。
2.实验动物造模
T2DM组小鼠先进行6周高脂膳食（购自上海斯莱克公司，配方见表3-1）饲养，高脂膳食饲养结束后注射链脲佐菌素（STZ）（用量标准为80 mg／kg，注射用的STZ要避光配制，配置好后要在0.5 h内注射完。），注射结束2周后利用血糖仪检测小鼠（空腹12 h后）血糖浓度，凡是＞8 mmol／L的为造模成功小鼠（即T2DM小鼠），T2DM小鼠血糖浓度为（11.288 8±2.522 5）mmol／L共54只（在高脂膳食饲养过程中死亡2只小鼠），造模成功率为93.1%。正常对照组小鼠喂以普通小鼠饲料。造模成功后，T2DM对照组（TC组，16只）小鼠继续给予高脂膳食以维持胰岛素抵抗，两组小鼠均自由饮水。
表3-1 高脂膳食饲料配方
3.实验动物干预
正常对照组（ZC组）和T2DM（TC组）小鼠造模检测成功后，在正常情况下于鼠笼中饲养8周，不进行运动干预。8周后，摘除眼球取血后断颈椎处死小鼠，对相关组织进行取材并检测相关指标。
4.实验动物取材
小鼠摘除眼球，用1.5 mL离心管收集小鼠全血，置于温度为4℃环境中过夜后按照1 000次／min×10 min进行离心，取上层血清并将其保存于—80℃冰箱中已备ELISA检测相关指标；用剪刀将小鼠头取下，去除附着在颅骨上的皮毛和肌肉等软组织，将颅骨内外的骨膜去除干净，以备颅骨茜素红、ALP和TRAP染色；取小鼠双后肢并将附着的肌肉等软组织去除干净，以备micro-CT检测骨组织形态计量学指标和石蜡切片后的Van Gieson和HE染色；取小鼠前肢骨（部分保留软组织）备用。
5.主要试剂和仪器
表3-1和表3-2所示为实验用的主要试剂和仪器。
表3-2 实验用的主要试剂
表中：NaCl为氯化钠；Na2 HPO4·12H2 O为十二水磷酸氢二钠；KH2 PO4为磷酸二氢钾；KCl为氯化钾。
表3-3 实验用的主要仪器
续 表
表中：Skyscan Micro-CT为显微CT技术；p H为氢离子浓度。
6.主要试剂的配制
1）4%PFA
在1 000 mL磷酸盐缓冲液（PBS溶液）中加入40 g多聚甲醛（PFA），密封混匀，置于37℃水浴锅中过夜（常温不易溶解），待完全融化后置于4℃冰箱中保存。
2）0.5 mol EDTA
在1 000 mL双蒸水（ddH2 O）放入146.1 g乙二胺四乙酸（EDTA，相对分子质量292.2），并将容器置于p H计上，需加入NaOH（前期可以直接加固体NaOH，后期微调时用液体NaOH）将溶液p H值保持在8.0以上（因为EDTA在p H值＞8.0时才能溶解，低于该值时不溶解），待EDTA充分溶解后将p H值调至8.0保存使用。
3）10×PBS溶液
利用电子秤称取20.84 g Na2 HPO4·12H2 O、80 g NaCl、2 g KH2 PO4和2 g KCl，将上述粉末加入ddH2 O中并定容至1 L，用p H计调整p H值至7.4，常温保存备用。
4）0.1%Triton-X100溶液配制
1 000 mL 1 X PBS溶液中加入1 mL的Triton-X100，用手摇晃使其溶解（注：因为Triton-X100黏稠，利用移液枪吸取时要将枪头前方剪去一部分，枪头直接打到溶液中，让Triton-X100充分溶解），常温保存备用。
5）PBST溶液配制 (https://www.daowen.com)
1 000 mL 1×PBS溶液中加入1 mL吐温（Tween），摇匀使其完全溶解，常温保存备用。
7.实验动物取材及相关指标检测
1）小鼠体重
于第8周结束，用电子秤测量ZC组和TC组小鼠的体重，记录相关数据。
2）小鼠股骨和胫骨骨重和骨形态指标检测
小鼠断颈椎处死后，取右侧后肢骨，去除软组织并将股骨和胫骨分开（操作要慢，以防股骨和胫骨断裂）。用电子秤对股骨和胫骨进行称量，并利用游标卡尺测量股骨和胫骨的长度，以及远端矢状轴、远端冠状轴、中间矢状轴、中间冠状轴、近端矢状轴及近端冠状轴，测量结束后对相关数据进行统计学分析。
3）小鼠骨组织形态计量学检测
小鼠断颈椎处死后，取右侧后肢骨，剔除肌肉等软组织，用4%PFA固定24 h后置于75%酒精中保存，以备用检测骨组织形态计量学等相关指标。利用Skyscan micro-CT系统（型号：1076）按照每帧18μm的规格对小鼠股骨进行扫描，扫描结束后用micro-CT软件对松质骨和皮质骨的骨组织形态计量学相关指标进行分析，获得松质骨和皮质骨的三维结构图和骨组织形态计量学指标的相关数据。
4）小鼠股骨Van Gieson染色
小鼠断颈椎处死后，取左侧后肢骨，剔除肌肉等软组织，PBS清洗后用4%PFA固定24～36 h，再用PBS清洗，用1%EDTA对骨组织进行脱钙处理，一般为14天，中间换液一次（直至骨组织变软为止）。脱钙结束后，用ddH2 O对骨组织进行清洗（每次2 min，清洗10次；如果EDTA脱钙不充分会影响后面的染色）。清洗结束后在PBS中浸泡2～3 h，然后按照50%（2 h）、75%（2 h）、85%（2 h）、95%（2 h）、95%（4℃环境中过夜）、100%（2 h）、100%（2 h）顺序进行酒精梯度脱水，脱水结束后酒精与二甲苯按照1∶1配制（2 h）、二甲苯Ⅰ（2 h）和二甲苯Ⅱ（2 h）进行透化（因骨组织较为致密，延长透化时间利于进蜡），透化结束后按照1号蜡5 h、2号蜡过夜、3号蜡5 h（3号蜡的浸蜡时间可适当延长）进行骨组织浸蜡。浸蜡结束后，对骨组织石蜡包埋后进行修片，然后用切片机按照6μm切片，温度62℃烤片2 h，然后在37℃条件下过夜（防止脱片，此步骤最为重要）。切片于62℃烤片0.5 h后，按照二甲苯Ⅰ、Ⅱ以及100%、95%、85%、75%、50%酒精进行脱蜡和水化后，用0.1%的Triton-X100（15 min）和PBST（10 min）处理，然后按照Van Gieson染色步骤（只是利用Van Gieson染液对小鼠骨组织进行染色）对骨组织进行染色，染色结束后按照75%、85%、95%、100%酒精以及二甲苯Ⅰ、Ⅱ步骤进行脱水，置换并利用中性树脂对切片封面。封片结束后，用显微镜拍照。
5）小鼠股骨HE染色
小鼠骨组织取材、股骨脱钙、脱水、浸蜡、包埋及切片等步骤同小鼠股骨Van Gieson染色，按照HE染色标准步骤对股骨进行染色，染色结束后封片并用显微镜对切片拍照。HE染色步骤如下：
（1）将石蜡切片置于烤片机上，于50℃下将切片烤干（一般约30 min即可）。
（2）将石蜡切片置于装有二甲苯的玻璃缸中进行脱蜡，5 min／次×1次。注意：在将切片放入酒精前要将切片上的二甲苯吸干。
（3）进行石蜡切片复水：100%酒精3 min／次×2次；95%酒精3 min／次×1次；85%酒精3 min／次×1次；75%酒精3 min／次×1次；50%酒精3 min／次×1次；ddH2 O 3 min／次×1次。
（4）苏木精染色，5 min。
（5）将切片置于玻璃缸中，并放于自来水下清洗5 min（时间可适当延长）。
（6）清洗结束后，将切片置于酸醇液中（1%盐酸溶解于70%酒精中），直至切片变为粉红色。
（7）将切片置于玻璃缸中，水龙头下清洗1 min，重复1次。
（8）ddH2 O清洗2 min。
（9）将切片慢慢地放入0.1%氨水溶液中，5～6次，直至切片颜色变暗。
（10）将切片放入伊红染液中染色30 s～1 min。
（11）流水下清洗5 min。
（12）然后用酒精进行梯度脱水：85%酒精2 min；95%酒精2 min／次×2次；100%酒精2 min／次×2次。
（13）二甲苯Ⅰ5 min，二甲苯Ⅱ5 min。
（14）用中性树胶和盖玻片封片。
（15）显微镜拍照。
8.实验数据处理
采用Excel、GraphPad Prism 5和SPSS18.0对实验检测的数据进行统计学分析，并对相关实验数据进行单因素方差分析。P＜0.05和P＜0.01分别表示差异具有统计学显著性和差异具有非常显著性。