运动对T2DM小鼠骨中cAMP／CREB／Atf4途径及骨形成代谢作用的影响
T2DM引起的骨质疏松发生与骨形成被抑制密切相关，且该过程受众多因素调控，如信号通路、激素、能量代谢等。c AMP／CREB／ATF4信号通路为调控骨形成的关键途径，当cAMP浓度升高后可激活下游PKA，而PKA可在CREBSer133位点上将其磷酸化，CREB活化后可通过活化ATF4调控骨钙素（OCN）、骨钙蛋白等靶基因表达，影响成骨细胞分化产生及骨形成，改善骨密度（BMD）。而生命医学领域内，Rendina-Ruedy等研究均证实，T2DM小鼠骨中c AMP／CREB／ATF4通路被抑制后，抑制成骨细胞分化及骨形成能力，骨量下降。运动作为改善骨代谢的有效手段之一，其在促T2DM骨形成上具有重要的作用。目前体育科学领域内，有关c AMP／CREB／ATF4途径介导不同方式的运动影响T2DM小鼠骨形成代谢的相关研究尚未见报道。基于以上，本研究利用高脂膳食和注射链脲佐菌素（STZ）法进行T2DM小鼠造模，并用游泳和下坡跑对小鼠进行运动干预。从mRNA、蛋白、细胞、骨量等层面对以下研究假设进行验证：①T2DM小鼠骨形成代谢被抑制；②下坡跑可激活T2DM小鼠骨中c AMP／CREB／Atf4途径进而促进成骨细胞分化产生及成骨能力，提高BMD，且其作用效果优于游泳。
1.研究材料与方法
1）实验动物及分组
4周龄雄性C57BL／6小鼠40只［购自上海西普尔—必凯公司，生产许可证号：SYXX（沪）2015-0011］，适应性喂养1周后随机分为正常对照组（ZC，n＝10只）和T2DM造模组（30只）。T2DM造模组小鼠造模成功后随机分组，并进行8周游泳和下坡跑运动训练。T2DM小鼠继续予以高脂膳食，ZC小鼠喂以普通饲料，均自由饮水，昼夜比为1∶1（实验动物伦理编号：M20150311）。
2）T2DM造模及训练
T2DM小鼠前6周给予高脂膳食（繁殖鼠料54.6%、猪油16.9%、蔗糖14.0%、酪蛋白10.2%、预混料2.1%和麦芽糊精2.2%，购自上海斯莱克公司）。6周高脂膳食结束后空腹12 h，按80 mg／kg标准一次性注射STZ，ZC组小鼠按体重标准注射柠檬酸／柠檬酸钠溶液。2周后再空腹12 h，采用Roche血糖仪检测血糖，凡血糖≥8 mmol／L为T2DM小鼠，27只造模成功，将造模成功的小鼠随机分为T2DM对照组（TC组，n＝9只）、T2DM＋游泳组（TS组，n＝9只）和T2DM＋下坡跑组（TD组，n＝9只）。T2DM小鼠造模成功且分组结束后，分别利用游泳和下坡跑对TS组和TD组小鼠进行运动干预，具体方案如下。游泳：水温（31±1）℃，每次50 min，每天1次，每周6天，共8周；下坡跑：每次50 min，坡度—9°角，每天1次，每周6天，共8周。
3）实验动物取材
小鼠摘除眼球后用1.5 mL EP管收集全血，4℃过夜后按1 000次／min×10 min进行离心，取血清以备ELISA检测c AMP浓度；取小鼠右侧后肢（清除肌肉等软组织），股骨用于检测相关因子mRNA表达，胫骨用于检测相关因子蛋白表达；取小鼠BMSCs并诱导其向成骨细胞分化，利用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染液检测成骨细胞活性；取小鼠左后肢并将肌肉等软组织去除干净，以备利用micro-CT检测股骨远端BMD。
4）指标检测
（1）血清中c AMP浓度检测：取小鼠血清，按c AMP试剂盒（购自R＆D公司）步骤要求对其浓度进行检测，按照酶标仪读取数据进行处理。步骤如下：准备好1×PBS、双蒸水等；将抗体和血清样本进行稀释，再按标准步骤进行c AMP浓度检测（每个样本做一个副孔），利用酶标仪对酶标板的每个孔的吸光值（在450 nm波长处读数）进行检测。
（2）骨中相关因子mRNA表达检测：取小鼠右侧股骨研磨后，按标准步骤提取RNA，按反转试剂盒（购自Takara Bio）标准步骤将RNA反转为cDNA，再按定量试剂盒（购自Takara Bio）标准步骤对相关靶基因的mRNA表达进行检测。相关引物序列利用Primer premer软件进行设计（见表4-17）并由上海生工生物工程有限公司进行合成。
表4-17 引物序列一览表
续 表
（3）骨中相关因子蛋白表达检测：组织研磨后，提取蛋白并检测其浓度（利用BCA法），利用PBS将蛋白调到同一浓度后加等量Loading buffer，于95℃水浴锅中5 min变性。结束后，12 000×g离心2 min，混匀，再重复一次。配制分离胶和浓缩胶（需提前配制），加样并进行电泳。结束后，将PVDF膜于甲醇中浸泡并进行转膜。将膜于0.2%丽春红中50 s后，用ddH2 O洗膜，随后5%脱脂奶粉封闭1～2 h。然后，孵Ⅰ抗（购自CST，兔源，稀释1 000倍）且4℃过夜。TBST洗膜，每次10 min，共4次。孵Ⅱ抗（购自Jackson）2 h，TBST洗膜4次，每次10 min。将PVDF膜置于显影液中用Alpha凝胶成像系统进行显影拍照，并用自带软件进行数据分析。
（4）BMSCs分化产生的成骨细胞活性检测：小鼠处死后置于75%酒精中灭菌，转无菌操作台中，取小鼠BMSCs制成单细胞悬液，并利用血细胞计数板进行计数。按50万／孔接于24孔板中，细胞均匀地铺于孔中后置于培养箱（37℃，5%CO2浓度）中进行培养，每隔2～3天换液（同时观察细胞的生长状况）。6天后培养基中加入维生素C（×1000）和β甘油磷酸（×100）诱导BMSCs向成骨细胞分化，2～3天换一次液。分化在第7天，取24孔板吸除培养基后，用4%PFA固定，利用ALP染液（配制方法：0.002 g AS-MAX和0.006 g Fast Red Violet LB Salt溶于5 mL p H值8.3的Tris-Hcl和5 mL ddH2 O中）对成骨细胞进行染色，结束后利用Canon数码相机进行拍照。
（5）BMD检测：取小鼠左侧后肢骨，采用4%PFA固定24 h后，用Skyscan Micro-CT系统（型号：1076）按每帧18μm规格对股骨远端BMD进行扫描，利用CT An软件获取松质骨和皮质骨BMD数据进行分析。
5）数据分析
采用Excel、GraphPad Prism 5和SPSS18.0对实验检测的数据进行统计、分析（ZC组和TC组进行独立样本T检验，TC组、TS组和TD组进行单因素方差分析），P＜0.05和P＜0.01分别表示差异具有显著性和差异具有非常显著性。
2.研究结果
1）不同运动对T2DM小鼠c AMP的影响
分析表4-18可知，与ZC组相比，TC组c AMP浓度显著下降（P＜0.01）；与TC组相比，TD组c AMP浓度显著升高（P＜0.01）；与TS组相比，TD组c AMP浓度显著升高（P＜0.05）。
表4-18 不同运动对T2DM小鼠血清中cAMP浓度的影响（
，n＝6）
注：与ZC组相比，**P＜0.01；与TC组相比，★★P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05。
2）不同运动对T2DM小鼠骨中相关因子mRNA表达的影响
分析表4-19可知，与ZC组相比，CREB、ATF4、OC、OCN和GBP的mRNA表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。与TC组相比，TS组OCN和BGP的mRNA表达显著上调（P＜0.05或P＜0.01），TD组CREB、ATF4、OCN和BGP的mRNA表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01）。与TS组相比，TD组CREB、ATF4和OCN的mRNA表达均显著上调（P＜0.05或P＜
0.01）。 (https://www.daowen.com)
表4-19 不同运动对T2DM小鼠骨中相关因子mRNA表达影响（
，n＝6）
续 表
注：与ZC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TC组相比，★P＜0.05，★★P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
3）不同运动对T2DM小鼠骨中CREB蛋白表达的影响
由图4-20和表4-20可知，与ZC组相比，TC组CREB蛋白表达显著下调（P＜0.01）。与TC组相比，TD组CREB蛋白表达显著上调（P＜0.05）。
图4-20 不同运动对T2DM小鼠骨中CREB蛋白表达影响
注：CREB为c AMP反应元件结合蛋白；GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶。
表4-20 不同运动对T2DM小鼠骨中CREB蛋白表达影响（
，n＝6）
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
4）不同运动对T2DM小鼠BMSCs分化产生成骨细胞活性的影响
由图4-21（彩图见附录）所示为利用ALP染液对BMSCs分化产生的成骨细胞染色后发现，与ZC组相比，TC组成骨细胞活性显著下降。与TC组相比，TS组和TD组成骨细胞活性显著升高。与TS组相比，TD组成骨细胞亦显著升高。
图4-21 不同运动对T2DM小鼠成骨细胞活性的影响
5）不同运动对T2DM小鼠BMD的影响
分析表4-21可知，与ZC组相比，TC组BMD显著下降（P＜0.01）；与TC组相比，TD组BMD显著升高（P＜0.01）。
表4-21 不同运动对T2DM小鼠股骨松质骨BMD的影响（
，n＝6）
注：与TC组相比，**P＜0.01；与TC组相比，★★P＜0.01。
3.分析讨论
T2DM为一种受多因素影响的代谢综合征，其并发症骨质疏松的发生与骨形成被抑制密切相关。T2DM骨形成被抑制的过程受多因素调控，如激素、信号通路等。而调控骨形成代谢的关键途径——c AMP／CREB／ATF4，可调控成骨细胞分化产生及骨形成能力，进而影响骨形成代谢。体内和体外研究均证实，T2DM通过抑制c AMP／CREB／ATF4途径，使得成骨细胞分化及骨形成能力下降。本研究中，T2DM小鼠c AMP浓度下降，骨中CREB的mRNA和蛋白表达及ATF4、OCN、BGP和BSP的mRNA表达均显著下调。说明，T2DM小鼠骨中c AMP／CREB／ATF4途径被抑制并下调其靶基因表达。究其原因，与T2DM小鼠骨中BMP-9和BMP-10表达下调有关，研究证实，BMP-9／10氨基酸序列2792-2887位点和2864位点半胱氨酸与CREB的bZip功能域结合，激活c AMP／CREB／ATF4途径及靶基因Runx2、OCN、BGP等表达。
运动改善T2DM小鼠的骨形成，且因运动方式不同对骨产生的力学刺激方式存在较大的差异，故运动对促进骨形成的作用亦不同。在体育科学领域内，探究运动改善T2DM小鼠骨形成的相关研究集中在骨表型上，其分子机制尚不清晰。本研究中，游泳组小鼠c AMP浓度及CREB、ATF4和BSP mRNA或蛋白表达均不显著，但OCN和BGP的mRNA表达均上调，表明游泳运动不能激活T2DM小鼠骨中c AMP／CREB／ATF4途径，可能存在另外途径激活靶基因OCN和BGP的表达。另外，OCN和BGP仅为mRNA表达上调，而其蛋白表达水平仍不清楚。有研究发现，OCN和BGP是在翻译后发挥作用的。下坡跑可显著提高T2DM小鼠c AMP浓度，骨中CREBmRNA和蛋白及ATF4、OCN和BGP的mRNA表达均上调，而BSP mRNA表达不显著。表明下坡跑激活T2DM小鼠骨中c AMP／CREB／ATF4途径及靶基因表达。分析两组结果的差异，与游泳和下坡跑对T2DM小鼠骨产生的力学刺激方式不同有关。与游泳对T2DM小鼠骨产生的间接作用力（即肌肉对骨的牵拉力）相比，下坡跑产生的直接作用力（地面对骨产生的反作用力）可激活T2DM小鼠骨中磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4，PDE-4）和细胞外调节激酶（extracellular signal regulating kinase，ERK），进而活化核糖体S6激酶和N-甲基-D-天冬氨酸激酶，激活c AMP／CREB／ATF4途径及靶基因表达。并且激活PGE2后，通过作用于前列腺素E受体2（prostaglandin E receptor 2，EP2），亦可激活T2DM小鼠骨中c AMP／CREB／ATF4途径。T2DM小鼠骨中腺苷A1和A2A受体被激活后，下游Gi／o蛋白偶联受体及A2AR-Gs-AC-c AMP通道活化，进而激活c AMP／CREB／ATF4途径及靶基因OCN和BGP等表达。
成骨细胞为主导骨形成的细胞，其由BMSC分化产生。成骨细胞分化增多时，骨形成能力及骨形成代谢增强。研究发现，患T2DM后，分化产生成骨细胞的数量显著减少，骨形成能力下降。目前相关研究较多，在此不再赘述。本研究中，T2DM小鼠分化产生成骨细胞数量减少，骨形成能力下降，这与前人研究结果相一致。究其原因，与本研究中T2DM小鼠骨中c AMP／CREB／ATF4途径被抑制密切相关，Kim等和Yang等研究均证实，c AMP／CREB／ATF4途径中ATF4表达下调，抑制BMSCs向成骨细胞的分化及活性。运动作为改善骨代谢的有效手段，可促进成骨细胞分化及骨形成能力。Menuki等研究证实，自主爬梯训练促进C57BL／6小鼠成骨细胞分化产生。David等研究亦证实，力学刺激促进小鼠骨原细胞向成骨细胞分化产生。本研究中，游泳和下坡跑均可显著促进T2DM小鼠成骨细胞分化产生及活性，且与游泳运动相比，下坡跑促T2DM小鼠成骨细胞分化产生及活性作用更好。说明游泳和下坡跑均可提高成骨细胞骨形成能力，以下坡跑作用效果更好。与游泳相比，下坡跑产生的直接作用力显著激活T2DM小鼠骨中cAMP／CREB／ATF4途径及靶基因OCN、BGP等表达，促进前成骨细胞（即骨祖细胞）向成骨细胞分化并提高其成骨能力。另外，与直接作用力可激活T2DM小鼠骨中BMP-2、Smad1／5和Runx2表达有关。Li等研究发现，激活BMP／Smad途径及下游靶基因Runx2高表达，促进T2DM大鼠骨原细胞向前成骨细胞和成骨细胞的分化产生。
BMD是评价骨代谢的最经典指标，患T2DM后，骨量和BMD显著下降，这已被很多研究证实。在本研究中，T2DM小鼠BMD也显著下降，与前人研究结果相一致。当T2DM小鼠成骨细胞数量及骨形成下降时，使得BMD减少。James等研究证实，当成骨细胞骨形成能力下降时，Col1、OCN、BSP等有机质合成减少，钙、磷等矿物质不能沉积，使得BMD下降。也与T2DM小鼠骨吸收代谢增强，破骨细胞蚀骨功能提高有关。运动作为提高T2DM小鼠BMD的有效手段。研究证实，运动可显著提高T2DM小鼠BMD。在本研究中，游泳改善T2DM小鼠BMD的作用不显著，而下坡跑却可显著提高BMD。这与不同运动对T2DM小鼠骨产生的力学刺激方式不同，而下坡跑对T2DM小鼠产生的直接作用力促进成骨细胞分化产生及骨形成能力，使得骨中Col1等有机质增多，便于矿物质沉积有关。直接作用力亦可激活T2DM小鼠骨中Wnt／β-catenin通路，该通路被激活可促进成骨细胞分化、成熟，同时抑制破骨细胞分化产生、融核及骨吸收，使得T2DM小鼠松质骨BMD增加。
4.结论
T2DM小鼠骨形成代谢被抑制，通过下坡跑可激活T2DM小鼠骨中c AMP／CREB／Atf4途径，促进成骨细胞分化及骨形成能力，提高BMD，且下坡跑作用效果优于游泳。