一、材料与方法
1.实验动物
同本章第一节所述的实验动物。
2.实验动物造模
用本章第一节所述的实验动物造模。
3.实验动物干预
用本章第一节所述的实验动物进行干预。
4.实验用的主要试剂和仪器
表3-9和表3-10所示为实验用的主要试剂和仪器。
表3-9 实验用的主要试剂
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注：NaCl为氯化钠；Na2 HPO4·12H2 O为十二水磷酸氢二钠；KH2 PO4为磷酸二氢钾；KOH为氢氧化钾；Alizarin Red为茜草素红；Alpha Medium为Alpha介质；Triton X-100为聚乙二醇辛基苯基醚；Tween-20为聚山梨醇酯-20；Nao H为氢氧化钠；Na2 CO3为碳酸钠；Glycine为甘氨酸；Tris为三羟甲基氨基甲烷；Na HCO3为碳酸氢钠；Fuchsin S为品红；PVDF为聚偏二氟乙烯；ECL为发射极耦合逻辑电路；RIPA为可溶性蛋白；BCA为钠盐；Marker为分子量标准。
表3-10 实验用的主要仪器
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注：PCR Tubes为薄壁导热离心管；CO2为二氧化碳；ABI Veriti96孔梯度PCR仪为基因扩增仪；PCR为聚合酶链式反应；p H为氢离子浓度。
5.实验用的主要试剂配制
1）Western-blotting测试用相关试剂
（1）10×TG缓冲液：用电子秤称取144.4 g Glycerine（甘氨酸）和30.3 g Tris（三羟甲基氨基甲烷），先溶解于少量的ddH2 O中，然后定容至1 L，在室温环境下保存备用。
（2）电泳液：100 mL 10×TG缓冲液中加入10 mL 10%SDS，用ddH2 O定容至1 L。
（3）10×TBS：称取80 g NaCl和24.4 g Tris，利用900 mL ddH2 O进行溶解，并调节p H值为7.6，然后定容至1 L。
（4）转膜缓冲液：①100 mL 10×TG缓冲液中加入200 mL甲醇，定容至1 L（注：配制的这种转膜液适用于相对分子质量为150 000以下的蛋白）；②电子秤称取5.8 g Tris、0.037 g SDS和2.9 g甘氨酸，利用少量ddH2 O进行溶解，并加入200 mL甲醇，ddH2 O定容至1 L（注：该转膜液适用于相对分子质量为150 000以上的蛋白）。
（5）蛋白封闭液：用量筒量取100 mL TBST加入5 g脱脂奶粉，混匀后在4℃环境中保存备用。
2）IBMx母液配制
利用电子秤称取0.011 5 g IBMX（0.5×10—4 moL），利用移液枪量取940μL的ddH2 O和60μL 1 mol／L的KOH，将以上三者混匀溶解，得到50 mmol／L的IBMX母液（注：IBMX的母液要现用现配，不可提前配制）。
3）脂肪细胞诱导分化液配制
诱导液Ⅰ：按照59 mL DMEM（10%FBS）、600μL IBMX母液、60μL地塞米松（1 mmol／L，即0.39 g地塞米松溶于1 L无水乙醇中）和140μL DMEM的比例配制60 mL体系的脂肪细胞分化诱导液Ⅰ。
诱导液Ⅱ：按照59 mL DMEM（10%FBS）、200μL胰岛素（将胰岛素粉末溶解至稀盐酸溶液中，在溶解过程中要先将胰岛素制备成悬浊液，然后一点一点地加入稀盐酸，最后进行定容）和800μL DMEM的比例制备成60 mL的脂肪细胞分化诱导液Ⅱ。
4）油红O染液的配制
染色液的配制：利用电子秤称取0.5 g油红O粉末，溶于少量的异丙醇中，然后加入异丙醇定容至100 ml，置于60℃水浴锅中使其溶剂，待油红O粉末完全溶解后置于4℃冰箱中保存（注：油红O的储备液要避光保存）。油红O工作液的配制：取6 mL已配制好的油红O储备液和4 mL ddH2 O（按照体积比3∶2的比例进行配制），混匀，并用定性滤纸过滤，过滤好的油红O染液要在2 h内用完，否则染色效果会下降。
5）Ag NO3染液配制
称取0.4 g Ag NO3并将其放入10 ml ddH2 O中使其溶解（注：Ag NO3染液在配制过程中要注意避光，防止Ag NO3被氧化；Ag NO3染液浓度在3%～5%均可，浓度要求不是很严格）。
6）茜素红染液
利用电子秤称取10 mg Alizarin Red和4 g KOH放入200μL ddH2 O中溶解混匀，从而制备50 mg／L的茜素红染液体系（当需要的染液体积较大时可按照上述体系进行等比例扩大）。(https://www.daowen.com)
7）ALP染液
利用电子秤称取0.002 g AS-MAX和0.006 g Fast Red Violet LB Salt，将以上两种药品溶解至5 mL的p H值为8.3的Tris-Hcl和5 mL ddH2 O的10 mL溶液中，配好后要尽快使用，不宜拖延时间太长（注：由于利用电子秤称取的两种药品的量比较少，有时也可利用枪头在试剂瓶中沾一点即可）。
8）Van Gieson染液配制
利用电子秤称取2.5 g Fuchsin S并用移液枪吸取5 mL Niuie Aeio70和10 mL Glycerine，将以上试剂混合置于900 mL Picric Acid satured solution，待其混匀溶解后放于4℃冰箱中保存备用。
6.实验指标检测
1）小鼠骨组织中相关细胞因子的mRNA表达检测
（1）胫骨和股骨中RNA提取：研磨用的钢珠事前利用DEPC水进行浸泡处理，将其置于研磨管中并用PBS对左侧股骨和胫骨进行清洗，然后剪碎后放入研磨管中并加入1 mL的Trizol，将研磨管置于Omini磁珠匀浆机上进行组织研磨。研磨结束后按照如下步骤提取股骨和胫骨组织中的RNA：①将装有组织和Trizol的研磨管置于离心机中进行离心（12 000×g，4℃，5 min），取上清并置于新的1.5 mL的EP管（无RNA酶）中。②加入200μL三氯甲烷（氯仿，按照1 mL Trizol的标准），上下颠倒，静置5 min后于离心机中进行离心（12 000×g，4℃，15 min）。③取上清（不能吸到下层的白色液相层）置于新的1.5 mL EP管（无RNA酶）中，加入500μL异丙醇（按照1 mL Trizol标准），上下颠倒混匀，静置3～5 min后离心（12 000×g，4℃，10 min）。④去除上清（尽量吸干净），加入75%酒精（利用DEPC水进行配制），上下颠倒几次，静置3～5 min后进行离心（12 000×g，4℃，5 min）。⑤洗掉75%酒精后，放置3～5 min，待酒精蒸发完（待EP管底部侧壁上的白色固体消失，亦可用鼻子闻，到没有酒精味为止），加20μL DEPC水。⑥测试RNA浓度。
（2）RNA反转为cDNA：利用反转试剂盒，按照上面的步骤将提取出的RNA反转为cDNA。如果要过几天使用，可将cDNA保存于温度为—20℃或者—80℃冰箱中。
（3）骨中相关细胞因子mRNA表达的定量检测：将cDNA稀释5倍，按照定量试剂盒上的步骤对靶基因进行定量检测。按照25μL标准配制反应体系（见表3-11），置于Stratagene Mx3005P荧光定量PCR仪中分别按照94℃×4 min、94℃×10 min、55℃×30 s、72℃×30 s、94℃×30 s、55℃×30 s、94℃×30 s，共45个循环，对目的基因进行检测。检测结束后对数据进行统计学分析。
（4）引物设计及序列：用Primer premer软件设计本研究中需要用到的相关细胞因子引物序列，由上海生工生物工程有限公司进行引物合成，然后鉴定引物的特异性，如果特异性不高需要重新设计。引物序列如表3-12所示。
表3-11 RT-PCR反应体系
注：SYBR为荧光定量检测试剂盒；DNA为脱氧核糖核酸。
表3-12 引物序列一览表
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注：Smad为Smad蛋白；BMP为骨成形蛋白；β-actin为β-肌动蛋白；COL1为Ⅰ型胶原蛋白；Osx为成骨细胞特异性转录因子；Runx2为Runt相关转录因子2；Osteocalcin为骨钙素；OCN为骨钙素；BSP为骨涎蛋白；ALP为碱性磷酸酶；OPN为骨桥蛋白；TGF-β1为转化生长因子-β1。
2）小鼠骨组织中相关细胞因子蛋白表达检测
（1）总蛋白的提取：取小鼠右侧股骨和胫骨（剔除骨上软组织），称取80 g并剪碎置于研磨管（已加入研磨用钢珠）中，加入蛋白提取液（蛋白酶和RIAP裂解液比例为1∶7），利用Omini组织匀浆机对骨组织进行研磨，重复3次。结束后置于冰上30 min，按14 000×g×20 min置于4℃离心机中离心，结束后取上清，用BCA法测定蛋白含量。取200μL上清裂解液并用PBS将蛋白浓度调整到同一浓度，加入等量的Loading缓冲液，95℃变性5 min，置于—80℃环境下保存备用。
（2）电泳：提前准备好电泳用胶（分离胶和浓缩胶）。将保存于—80℃冰箱中的样品取出，95℃隔水加热变性5 min，按12 000×g×2 min离心，混匀，然后再离心。靠近外侧的胶孔中加入蛋白标志物，然后按照一定的顺序每个孔中加入10μL的蛋白样，加完后盖好盖子并连接电源，先按80 V再按120 V进行电泳。
（3）转膜：电泳结束后，将胶取出，并将浓缩胶切除掉并处理干净。将PVDF膜置于甲醇中浸泡，待其湿润后并对其剪角标记，然后将PVDF膜和胶放在一起置于转膜液中10 min。海绵垫置于下面，铺上滤纸（一定要将气泡驱除尽），将胶和膜放上，上面再铺上滤纸和海绵垫（驱除气泡），夹板夹好，将胶一侧贴近负极放入转膜槽内，于100 V电压下转膜90 min。
（4）丽春红染色：转膜结束后用镊子将膜取出，放于0.2%丽春红染液中染色50 s左右，然后将膜放于双蒸水中清洗，观察转膜是否成功（如果没有气泡且见白色条带即为转膜成功）。然后按照标志物条带和目的蛋白分子量大小，将PVDF膜修剪成大小适宜的条带，利用TBST缓冲液将剪好条带上的丽春红清洗干净。
（5）条带封闭、Ⅰ和Ⅱ抗孵育：将条带置于已配制好的5%脱脂奶粉中1～2 h。结束后，利用已稀释好的Ⅰ抗（利用封闭液进行稀释，见表3-13），在4℃环境孵育过夜。收集抗体稀释液后，利用TBST洗膜，每次10 min，共4次。然后利用已配制好的Ⅱ抗室温孵育2 h。结束后再利用TBST洗膜，每次10 min，共4次。
表3-13 Ⅰ抗稀释比例及生产厂家
注：GPR48为G蛋白偶联受体48；Smad为Smad蛋白；p-Smad为磷酸化Smad蛋白；Col1为Ⅰ型胶原蛋白；OPN为骨桥蛋白。
（6）扫膜显影：取等体积A和B配制显影液，将显影液放于PVDF膜上并静置一会儿，吸去显影液，然后利用α凝胶成像系统进行显影拍照，并用自带软件进行分析。
3）小鼠BMSCs向成骨细胞分化及成骨能力检测
实验前准备：无菌操作台中需要准备移液管、10 mL注射器、1 mL注射器、15 mL离心管、35 mm培养皿、α-MEM、小牛血清（0号）、双抗、完全培养基及灭菌手术器械等。无菌操作台外需要准备75%酒精、手术器械及纱布等。
实验步骤：小鼠断颈椎处死后置于75%酒精中灭菌，用剪刀、镊子和纱布将小鼠后肢骨上的软组织去除干净。把小鼠后肢骨转移至无菌操作台中。小鼠后肢骨先在75%酒精中浸泡2～3 min后，每组分别装于不同的培养皿中（皿中装有已灭菌的PBS），分别清洗2遍。用已灭菌的剪刀剪除股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔，用10 mL注射器吸10 mL完全培养基（不加血清）并配1 mL针头，将股骨和胫骨骨髓腔中的骨髓冲到的50 mL的离心管中。2组小鼠的骨髓分别冲洗完毕后，摇动离心管欲将细胞冲打成单细胞悬液。取2个1.5 mL EP管，每个管中加入900μL红细胞裂解液，每组摇匀后吸取100μL单细胞悬液，加入EP管中混匀后，静止5 min后用血细胞计数板进行计数。计数结束后，按照50万／孔接于3个24孔板中，按120万／孔接于1个12孔板中。置于培养箱中进行培养，2～3天换一次液（视细胞的生长状况而定），6天后培养基中加入维生素C（×1 000）和β甘油磷酸（×100）诱导BMSC向成骨细胞分化，2～3天换一次液。分化的第7天，取一个24孔板吸除培养基后，用4%PFA进行固定，再用ALP染液对成骨细胞进行染色；吸除12孔板中培养基后，每孔加入500μL Trizol，按照标准步骤提取RNA，并将其反转为cDNA，用RT-PCR技术检测成骨细胞中相关基因的mRNA表达；剩余的2个24孔板继续进行诱导分化，到第14天结束。用茜素红和Von Kossa染色剂分别对成骨细胞进行染色，对成骨细胞的成骨能力进行检测，染色结束后利用数码相机进行拍照。
4）小鼠BMSCs向脂肪细胞分化检测
实验前准备：无菌操作台中需要准备移液管、10 mL注射器、1 mL注射器、15 mL离心管、35 mm培养皿、α-MEM、小牛血清、双抗、完全培养基、灭菌手术器械等。无菌操作台外需要准备75%酒精、手术器械及纱布等。
实验步骤：小鼠断颈椎处死后置于75%酒精中灭菌，用剪刀、镊子和纱布将小鼠后肢骨上的软组织去除干净。把小鼠后肢骨取好后转移到无菌操作台中。小鼠后肢骨先在75%酒精中浸泡2～3 min后，每组分别装于不同的培养皿中（皿中装有已灭菌的PBS），分别清洗2遍。用已灭菌的剪刀剪除股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔。用10 mL注射器吸10 mL完全培养基并配1 mL针头，将股骨和胫骨骨髓腔中的骨髓冲到50 mL的离心管中。两组小鼠冲洗完毕后，摇动离心管欲将细胞冲打成单细胞悬液。取2个1.5 mL EP管，每个管中加入900 μL红细胞裂解液，每组吸取100μL单细胞悬液，加入EP管中混匀，静止5 min后用血细胞计数板进行计数。计数结束后，按照50万／孔接于3个24孔板中，按120万／孔接于1个12孔板中。前两天利用脂肪细胞分化诱导液Ⅰ诱导BMSC分化，2天后进行换液，并用诱导液Ⅱ（不再用诱导液Ⅰ）进行诱导分化，2天后再用不含有诱导液的完全培养基进行培养。2～3天换液一次（视细胞生长状况而定），再培养8天。8天后弃培养基，并用4%PFA固定（15 min），固定结束后用PBS进行清洗，在室温条件下再用已配制好的油红O染液对脂肪细胞染色30 min，染色结束后吸除染液并用PBS清洗，结束后每孔再加入等体积的异丙醇来保持脂肪细胞湿润。用倒置显微镜拍照。
5）小鼠颅骨茜素红和ALP活性检测
小鼠断颈椎处死，取颅骨（剥除颅骨上肌肉等软组织，尤其是要将颅骨外表面和内表面上的骨膜剔干净），PBS清洗后置于4%多聚甲醛中，于4℃冰箱中固定24 h。固定结束后用0.1%Triton-X100于4℃冰箱中透化24 h，透化结束后用PBST于4℃环境中处理24 h，然后用已配制好的Alizarin Red和ALP染液对小鼠进行染色，一般0.5小时即可（有时由于染液与颅骨的反应不是很快，在此种情况下可适当延长染色的时间，但染色时间一定不能太长，这样会缩小不同组别之间的差异）。染色结束后，用数码相机对小鼠颅骨进行拍照。
7.数据统计
采用Excel、GraphPad Prism 5和SPSS18.0对实验数据进行统计学分析，并进行单因素方差分析。P＜0.05和P＜0.01分别表示统计学差异具有显著性和非常显著性。