三、讨论分析
当胰岛β细胞功能受到损伤且出现胰岛素抵抗时，容易导致机体出现T2DM。患病后机体内的低胰岛素和高血糖内环境使得机体的新陈代谢出现紊乱，对机体的肾脏、眼睛及骨代谢等均造成严重的影响。尤其是对骨代谢，长时间患T2DM后会导致骨质疏松，甚至发生骨折。TGF-β／BMP信号通路为调控骨形成代谢的重要信号通路之一。研究发现，T2DM通过抑制该信号通路从而抑制成骨细胞分化和骨形成能力。
图3-12 ZC组与TC组小鼠颅骨茜素红和ALP染色结果
TGF-β是一种具有多功能的细胞因子，其在组织再生、胚胎发育及骨组织代谢等方面都具有重要的作用。TGF-β通过与膜上受体丝氨酸／苏氨酸激酶受体——TβR-Ⅱ结合并将其激活，活化后的TβR-Ⅱ激活膜内受体TβR-Ⅰ，磷酸化胞质内的细胞信号分子Smad 2／3。Smad 2／3磷酸化后可与Smad 4结合，形成信号转导复合体进入核内调控相关靶蛋白的表达。激活Smad 7是另一条调控R-Smad功能的信号通路，其可以靶向调控TGF-β受体降解。Smad 7发生突变后，可抑制Smurf 2与其受体的结合及其活性。Smad 7是TGF-β信号通路的调节因子之一，可与Smad 4竞争性地与Smad 2／3形成复合体，从而在骨形成代谢、骨吸收代谢以及出生后的骨代谢平衡中发挥重要作用。研究发现，TGF-β／Smad信号通路的靶基因主要包括Runx 2、AP-1、bZIP、Fox、b HLH及Sp1等。近来，有研究发现，Smad 2／3还可与TRAF6-TAB1-TAK1分子复合体直接相互作用。当抑制TGF-β信号通路后，TRAF6-TAB1-TAK1分子复合体未被观察到，这说明TGF-β1在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中是必不可少的。当TGF-β1抑制成骨细胞分泌的RANKL（促进破骨细胞分化的重要细胞因子）的活性时，可促进骨基质的形成和成骨细胞的分化。因此，TGF-β1通过间接抑制破骨细胞形成来影响骨量。TGF-β／Smad信号通路及其靶基因Runx 2、骨钙蛋白（OCN）等表达下调，抑制了成骨细胞分化及其矿化。
TGF-β信号通路与BMP信号通路之间存在着密切的相互调控关系。TGF-β可强烈地增强BMP-2诱导的异位骨形成，其骨量是BMP-2单独诱导的5倍。在体外研究中，TGF-β1、FGF-2和PDGF-AB上调BMPR-ⅠB后可显著增强BMP-2诱导骨形成的功能。在研究BMP-9诱导C3H10T1／2细胞向成骨细胞方向进行分化时，发现BMPRⅡ和ActRⅡ是TGF-β的Ⅱ型功能受体，表明TGF-β1和BMP信号通路在成骨细胞分化过程中存在紧密的联系。BMPs可促进小鼠骨缺失的修复。在成骨细胞分化和骨形成过程中，BMP信号通路与Wnt、Notch、FGF和Hh信号通路相互之间也存在密切的关系。
BMP-2／4／5／6／7在调控成骨细胞分化和骨形成过程中均具有重要的作用。另外，BMP-2可大幅度地上调OCN表达，并且短期的BMP-2表达上调对于成骨细胞分化和骨形成是充足，且必不可或缺的。BMP-7可诱导成骨细胞分化标志物表达，如上调ALP活性且会加快钙离子的矿化。利用Prx1-cre模型进行体内基因研究证实，BMP-7缺失对于出生后四肢生长和骨量保持的作用并不是很明显，这说明成年骨组织内还存在其他的BMP，以弥补BMP-7缺失对骨造成的影响。当敲除BMP-2和BMP-4后，骨形成受到显著抑制。然而，当BMP-4缺失时四肢骨形成却仍然正常，这说明BMP-4对于四肢骨的骨形成代谢和功能并不是必不可少的。小鼠四肢骨不能合成分泌BMP-2，容易导致自主性骨折，即使对骨施加其他的骨形成刺激也不能弥补BMP-2缺失对骨产生的影响。在软骨发育过程中，BMP-2（而不是BMP-7）在软骨细胞增殖和成熟过程中扮演着重要的角色。有研究发现，BMP-3缺失的小鼠松质骨骨量是野生型小鼠的2倍。BMP-3抑制骨组织前体细胞分化为成熟成骨细胞，其可调节成年后骨量变化。
BMP-2的受体BMPR-Ⅱ可分别调节靶基因对BMP-2的作用。在2T3细胞内，BMPR-Ⅱ和ActR-ⅡB在功能可相互补充，以调节BMP-2信号通路和BMP-2诱导的成骨细胞分化。用Prx1-Cre技术敲除小鼠BMPR-Ⅱ后，其骨组织发育正常，说明BMPR-Ⅱ对四肢骨的发育不是必不可少的。另外一种机制是BMP可与其他的Ⅱ型BMP受体相结合，从而弥补BMPR-Ⅱ敲除后对骨产生的影响。相反，当利用Col1-Cre技术将BMPR-IA敲除后，小鼠的骨体积变大、四肢变短、肢体远端发育不全、身体变小、不规则钙化和低骨量等。而有研究发现，松质骨骨量的增加可能与OPG／RANKL／RANK信号通路抑制了破骨细胞形成有关。Neogenin为一种膜上蛋白，在BMP诱导的经典信号通路即磷酸化Smad1／5／8过程中可通过与脂质筏相结合从而发挥其调控作用。BMP信号通路过表达可通过ALK2导致Smad1／5／8的磷酸化异常。成骨细胞特异性敲除小鼠呈现骨质减少和BMP信号通路受到部分抑制等特征。Smad1／5／8不能正常结合导致严重的软骨发育异常。如果Smad1被修饰，其可调节BMP调控的骨形成，并且BMP信号通路的作用强度可被BMP受体通过Smad1的C端磷酸化来进行调控。综上所述，TGF-β／BMP信号通路在成骨细胞分化及成骨能力上具有重要的作用。
而GPR48不仅在很多生物学过程中起着重要的作用，而且其在骨组织代谢中也存在着重要的调控作用。当该基因缺失时骨形成代谢受到显著抑制而骨吸收代谢增强，使得骨量和骨密度降低。并且GPR48可通过TGF-β／BMP信号通路来发挥相应的生物学作用。目前，国内外有关GPR48通过TGF-β／BMP信号通路调控T2DM骨代谢的相关研究尚未见报道，但有关TGF-β／BMP信号通路调控T2DM骨代谢的相关研究却发现，T2DM可能通过TGF-β1基因表达上调来促进大鼠股骨骨质疏松的发生。Ma等在研究时用RT-PCR技术检测T2DM大鼠骨组织中的BMP-7和TGF-β1，发现它们均出现了显著变化，从而使得骨密度显著下降。
在本研究中，T2DM造模成功8周后，TC组小鼠骨组织中GPR48的mRNA和蛋白表达均出现显著下调，说明T2DM抑制了小鼠骨中GPR48表达。究其原因，可能与T2DM小鼠机体内胰岛素浓度降低，肝脏分泌产生的IGF-1减少，从而使得骨中GPR48表达下调进而也抑制了TGF-β／BMP信号通路中相关细胞因子的表达有关。Caselli等研究发现，IGF-1表达下降使得成骨细胞分化受到抑制且骨形成降低。研究还发现，TC组小鼠骨中TGF-β／BMP信号通路中的相关细胞因子的mRNA表达也均出现显著下降。说明T2DM抑制了小鼠骨组织中TGF-β／BMP信号通路中相关细胞因子的表达，这与前人研究结果相一致。分析其原因，与GPR48表达下调有关。表达下调的GPR48会抑制其下游TGF-β／BMP信号通路中相关细胞因子的表达。目前，国内外有关GPR48通过TGF-β／BMP信号通路调控T2DM骨代谢的研究尚未见报道。其生物学机制仍存在较多的不清晰之处，这可能将是以后生物学或者体育科学领域的研究热点之一。相信GPR48生物学功能的揭示对于以后防治因T2DM致骨质疏松或者骨折等具有重要的意义。(https://www.daowen.com)
1.T2DM对小鼠诱导分化产生成骨细胞中相关细胞因子mRNA表达的影响
T2DM是一种代谢性疾病，患病后机体的内平衡被打破导致骨代谢出现紊乱，使得骨质疏松等骨性疾病的发生。成骨细胞在诱导分化产生过程中受到很多细胞因子的调控，如GPR48、Runx2、Osx、DMP1及SOST等。Poon等研究发现，T2DM抑制成骨细胞分化产生并使得骨质疏松的发生，而在分化产生的成骨细胞中Runx2、DMP1、SOST和PHEX等促分化因子表达均出现显著下调。Fu等也发现T2DM会抑制成骨细胞的分化，并使得分化产生的成骨细胞中促分化细胞因子如Runx2、Osx、DMP1及SOST等表达下调。在本研究中得到了相同的结果，说明T2DM会抑制分化产生的成骨细胞中相关细胞因子的表达。究其原因，可能与GPR48表达下调存在密切关系。因为GPR48可通过激活下游的Wnt／β-catenin影响下游ALP、Runx2、Osx、DMP1及SOST等表达，进而抑制成骨细胞分化。也许可能与骨相关各信号通路受到抑制有关，尤其是TGF-β／BMP信号通路。研究发现，当抑制该信号通路表达时可使成骨细胞中的ALP、Runx2、DMP1等细胞因子表达受到显著抑制。目前，有关T2DM调控成骨细胞分化及成骨细胞中各促成骨细胞分化细胞因子的相关研究尚鲜有报道，其生物学机制尚不明确。
2.T2DM对小鼠成骨细胞和脂肪细胞分化及功能的影响
BMSCs是机体内具有多向分化潜能的干细胞，在一定诱导条件下可分化为成骨细胞、脂肪细胞等。由于BMSCs数量是一定的，当分化产生的脂肪细胞等增多时，分化产生的成骨细胞就会减少。徐飞在他的博士毕业论文中也证实，KK／Upj-Ay／J小鼠（自发性T2DM小鼠）分化产生的成骨细胞活性显著下降，而脂肪细胞数量增多。以上研究说明，T2DM使得小鼠由BMSCs分化产生的成骨细胞数量和成骨能力均显著下降，而由其分化产生的脂肪细胞却显著增多。
在本研究中，T2DM小鼠造模成功后8周，取小鼠BMSCs后进行原代培养，并利用ALP、茜素红和Von Kossa 3种染色方法对成骨细胞的骨形成能力进行检测，发现TC组小鼠成骨细胞的骨形成能力显著下降，说明T2DM抑制BMSC向成骨细胞分化及其成骨能力。Hamann等研究也发现，T2DM大鼠分化产生的成骨细胞数量减少，且其骨形成能力亦显著下降。这可能与患T2DM后骨中金属转运蛋白1（DMT1）表达上调有关。Zhang等发现，DMT1表达上调使得T2DM小鼠成骨细胞分化受到显著抑制。而Khan等发现，T2DM小鼠（db／db小鼠）成骨细胞骨形成能力下降与过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1（PGC-1α）表达变化有关，GTDF为脂联素受体1（AdipoR1）激动剂，下调了PGC-1α的表达从而抑制了成骨细胞的骨形成能力。这可能与T2DM小鼠骨中的TGF-β／BMP信号通路有关，Ehnert等在利用SCP-1永生化成骨细胞前体细胞研究T2DM对成骨细胞的影响时发现，TGF-β的表达下调与成骨细胞成骨能力下降存在密切关系。研究发现，T2DM使得BMP-2、BMP-4和BMP-7等BMP在血清、肾脏等组织均显著下调；而在生物学研究中，BMP-2／4／7等在调控成骨细胞分化及成骨能力上均具有重要作用。
在Matsukawa等研究发现，T2DM使得分化产生的脂肪细胞增多。Sanchez-Infantes等在研究抑癌蛋白m的生物学作用时发现，T2DM小鼠分化产生的脂肪细胞数量显著增多。综上，说明T2DM患病后可显著促进脂肪细胞的分化，并使其数量增多。在本研究中，T2DM造模成功8周后，小鼠BMSCs分化产生的脂肪细胞数量显著增多，这与前人研究结果相一致。说明T2DM促进小鼠体内脂肪细胞的分化这与小鼠体重增加尤其是脂肪数量增多存在密切的关系。究其原因，与小鼠BMSCs分化产生的成骨细胞减少存在密切关系。因为BMSCs在分化产生成骨细胞减少的情况下会导致分化产生的脂肪细胞增多，这种结果的生物学机制可能与T2DM激活PPARγ密切相关，因为当激活PPARγ表达时会促进脂肪细胞分化。Matsushita等发现，表达下调的Wnt／beta-catenin下调了核激素受体肝脏X受体-α（LXRα），促进MSC向脂肪细胞分化。这与本研究中TGF-β／BMP信号通路表达受到抑制有关。当抑制该信号通路后会激活PPARγ表达从而促进T2DM小鼠分化产生的脂肪细胞数增多。综上，说明T2DM造模成功后，在抑制BMSCs向成骨细胞分化、成熟和成骨能力的同时也会显著促进脂肪细胞的分化产生，从而降低T2DM小鼠的骨形成代谢。
3.T2DM对小鼠骨形成能力的影响
当胰岛β细胞功能受到损伤且出现胰岛素抵抗时，容易导致机体出现T2DM。然而T2DM会使得患病个体的骨代谢出现紊乱，而骨代谢之一的骨形成代谢亦受到负向调控的作用。研究发现，患T2DM后，骨形成代谢呈现负向调控，使得骨形成能力显著降低。碱性磷酸酶（ALP）是评价骨形成代谢的重要生化标志物，而茜素红染色是检测骨形成代谢的重要方法之一。徐飞发现，自发性T2DM雄性KK／Upj-Ay／J小鼠血清ALP出现显著下降，到骨形成能力下降。Devlin等在研究糖尿病对TALLYHO／JngJ小鼠骨代谢的影响时发现，T2DM使得小鼠骨形成能力显著下降。在本研究中，TC组小鼠颅骨茜素红和ALP染色均出现显著下降，说明T2DM使得小鼠骨形成能力出现显著下降。Jeyabalan等也发现，T2DM组小鼠骨形成能力出现显著下降，使得股骨的茜素红和ALP染色出现显著下降。He等也证实，T2DM可降低小鼠的骨形成能力，这与小鼠机体内胰岛素分泌减少和高血糖使得BMSC分化产生的成骨细胞减少及成骨能力下降存在密切的关系。有研究还证实，胰岛素浓度降低后，肠道对钙等矿物质的吸收降低，并且骨组织中骨细胞合成蛋白能力也降低，骨基质合成减少，从而使得骨质生长、骨钙化和骨形成能力降低。T2DM小鼠的骨形成能力下降与本研究中小鼠骨量和骨组织形态计量学显著下降存在密切关系。