三、讨论分析
1.T2DM对小鼠骨中GPR48表达的影响
研究发现GPR48不仅在精子形成、高血压、阿尔茨海默病等过程中扮演重要角色，而且在骨代谢中也扮演重要角色。Luo等在研究全身GPR48基因敲除小鼠骨生长发育时发现，GPR48基因缺失可通过c AMP／PKA／ATF4信号通路下调其靶基因ATF4表达从而使得破骨细胞、Col1和BSP等表达下调，抑制骨形成代谢。而T2DM是一种代谢性疾病，长时间患病会抑制骨形成并增强骨吸收，导致骨质疏松甚至骨折的发生。目前国内外研究中，有关GPR48调控T2DM骨代谢的相关研究尚未见报道。本研究中，在T2DM组小鼠骨中GPR48表达显著下降，说明T2DM抑制骨中GPR48表达。分析其原因，可能与小鼠机体内胰岛素浓度下降和高血糖存在密切关系，研究证实胰岛素浓度下降和高血糖使得骨吸收代谢显著增强，而前人研究也发现GPR48敲除后，个体的骨吸收代谢增强，骨形成代谢受到抑制。据此推测，T2DM骨中GPR48表达下降与胰岛素浓度下降和高血糖存在密切关系。有关GPR48调控T2DM骨代谢的相关研究的深入以及其生物学机制的揭示，为以后防止T2DM骨疾病的发生以及药物研发提供了新的靶点。
2.T2DM对小鼠骨中OPG／RANKL／RANK分子轴相关细胞因子mRNA表达的影响
OPG／RANKL／RANK分子轴是调控骨吸收代谢的重要调节轴之一，其在调控破骨细胞分化，成熟及骨吸收代谢中起着重要作用。RANK可通过激活破骨细胞前体细胞中的c-fos和NFATc1／NFATc2来促进破骨细胞分化、成熟。另外，很多细胞因子如IL-1、IL-6和IL-11等被很多研究证实，其可通过诱导成骨细胞表达RANKL从而使破骨细胞形成。细胞因子TNF-α不仅可通过直接刺激破骨细胞前体细胞，而且还可通过诱导干细胞表达RANKL和破骨细胞前体细胞表达RANK来促进破骨细胞形成。调控骨吸收代谢的另一重要细胞因子——TRAF6。研究发现，敲除TRAF6后会导致严重的骨质疏松，这证实TRAF6与OPG／RANKL／RANK分子轴之间存在密切的关系。另一研究检测到在RANK受体上的TRAF结合位点，说明TRAF6可能在破骨细胞功能发挥和正常的F-actin指环形成上起着重要的作用，其他TRAF参与的信号通路可能对RANK调控破骨细胞形成起着的重要作用。然而，在一项利用TRAF2缺乏的破骨细胞前体细胞的研究中发现，TRAF2对RANK信号通路起很小的作用，其却在依赖TNF-α调控破骨细胞形成过程中起着重要的作用。研究证实，破骨细胞中RANK信号通路的下游TRAF6可激活JNK1、AKT／PKB、p44／42ERK、p38MAPK和经典NF-κB通路。c-Src通过调控的RANK激活，使c-Src参与正常的破骨细胞发育中。在一有关破骨细胞分化的研究中，发现了一个对RANK信号通路的共刺激信号通路，该通路包括含相对分子量为12 000的DAP12和Fc受体g亚基（FcRg）的DNAX免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine based activation motif，ITAM）。这个共刺激信号通路通过激活下游蛋白酶（Syk），其激活磷酸化酶Cg（PLCg）、BTK和Tec激酶等来参与RANK调控破骨细胞形成，甚至导致NFATc1／NFATc2的钙离子调控的相关通路激活。有研究也发现，缺乏OPG的小鼠骨组织中破骨细胞数量增多，导致骨质疏松发生。综上所述，OPG／RANKL／RANK分子轴可通过调控其下游的相关靶基因的表达，从而通过不同的途径影响破骨细胞分化、成熟以及骨吸收功能进而影响骨吸收代谢。目前有关T2DM调控骨中OPG／RANKL／RANK分子轴相关细胞因子表达的研究发现，在T2DM大鼠牙槽骨中OPG表达下调，而RANK和RANKL表达显著上调。曾晓燕在人体研究中发现，T2DM患者血清中的RANKL表达升高，而OPG／RANKL值下降。动物和人体研究均发现T2DM会影响骨组织中OPG、RANKL和RANK的表达。
在本研究中，T2DM小鼠骨中的OPG和RANKL的表达下调，而RANKmRNA和蛋白表达均显著升高，说明T2DM可激活OPG／RANKL／RANK分子轴中相关细胞因子表达，这与前人的研究结果相一致。究其原因，可能与T2DM抑制骨中GPR48表达有关。在笔者所在实验室的前期研究中发现，GPR48可竞争性地与RANKL结合从而抑制骨吸收代谢。而在本研究中，T2DM小鼠骨中GPR48表达下调，使得RANKL更多地与RANK结合，促进破骨细胞分化成熟以及骨吸收代谢，使得骨量下降。患T2DM后会导致骨中m TORC1表达上调，而m TORC1表达上调会激活β-catenin信号通路，从而调控OPG／RANKL／RANK分子轴的激活和破骨细胞分化产生。还有研究发现，OPG／RANKL／RANK分子轴中相关细胞因子的表达变化可能与T2DM激活MAPK通路有关，因为当激活MAPKs通路后会使得T2DM患者骨中OPG表达下调，而RANKL和RANK表达升高。综上所述，T2DM通过抑制GPR48表达，激活OPG／RANKL／RANK分子轴促进破骨细胞分化产生、成熟以及骨吸收代谢，使得骨量降低。而OPG／RANKL／RANK为分子轴，其下游还有多条信号通路如CN／NFAT信号通路等，那么T2DM调控破骨细胞分化成熟及骨吸收代谢的相关生物学机制是否与OPG／RANKL／RANK分子轴下游的信号通路（CN／NFAT信号通路）存在密切的关系呢？目前相关研究还未见报道。
3.T2DM对小鼠骨组织中CN／NFAT信号通路中相关细胞因子mRNA表达的影响
CN／NFAT信号通路是破骨细胞中与OPG／RANKL／RANK分子轴密切相关的信号通路之一。活化T细胞核因子（transcription factor nuclear factor of activated T cells，NFAT）是一种钙离子调节性转录因子，CN活化后迅速转录进入细胞核内并与相应的靶基因结合，调控其转录进而影响破骨细胞的分化、成熟以及骨吸收功能。目前，有关CN／NFAT信号通路调控破骨细胞分化、成熟以及骨吸收代谢的相关研究较少，而有关CN／NFAT信号通路调控T2DM骨吸收代谢的相关研究尚鲜有报道。
本研究中，与ZC组相比，TC组小鼠骨组织中CN／NFAT信号通路中的相关细胞因子（CN、NFATc1、NFATc2、c-fos等）表达均出现显著上调，说明T2DM激活了小鼠骨中该信号通路的表达。目前有关T2DM影响骨中CN／NFAT信号通路表达的相关研究尚未见报道，缺乏相关的直接证据，与T2DM激活OPG／RANKL／RANK分子轴存在密切的关系。贺龙刚研究发现，RANKL通过与其膜上受体RANK结合，然后与TRAF6和c-Src形成三聚体进而激活下游的信号通路（如Ca2＋）中的相关细胞因子如NFATc1、c-fos，促进破骨细胞分化产生、成熟及骨吸收功能。Luo等研究GPR48全身基因敲除小鼠骨生长发育时发现，GPR48基因缺失抑制成骨细胞的分化，降低骨形成代谢。据此，T2DM骨中CN／NFAT信号通路中相关细胞因子的表达下调可能与GPR48表达下调存在一定的关系。本研究中也发现，T2DM会显著抑制成骨细胞分化产生和骨形成能力，而Anna的研究却发现，成骨细胞和破骨细胞之间是相互作用的，当分化产生的成骨细胞减少时，破骨细胞的数量却增多。那么骨组织中CN／NFAT信号通路及下游相关细胞因子表达的上调可能与TGF-β／BMP信号通路表达受到抑制存在一定的关系。(https://www.daowen.com)
4.T2DM对小鼠破骨细胞中相关细胞因子mRNA表达的影响
破骨细胞主要由造血干细胞分化产生，其分化过程为：①早期分化阶段，即造血干细胞向某一特定细胞的造血祖细胞分化；②造血祖细胞向破骨细胞前体分化；③造血祖细胞向TRAP阳性的单核前破骨细胞分化；④单核破骨细胞融核形成多核破骨细胞。在破骨细胞分化产生的每个阶段都受到很多细胞因子的调控，如PU.1在造血干细胞向破骨前体细胞分化中起着重要调控作用，TRAF6、NFATc1和c-fos在破骨前体细胞向单核破骨细胞分化，并且在后期融合形成多核破骨细胞中起着重要调控作用，c-Src在破骨细胞的骨吸收功能调节上具有重要的作用等。GPR48为众多信号通路或细胞因子的上游，在破骨细胞分化及骨吸收功能发挥上起着重要的调控作用。而TRAP是评价破骨细胞骨吸收功能重要生化标志物。患T2DM后会促进分化产生的破骨细胞数量增多，骨吸收代谢显著增强，导致骨质疏松甚至骨折的发生。但是目前有关T2DM调控分化产生的破骨细胞中相关细胞因子表达的研究还鲜有报道。
本研究中，与ZC组相比，TC组GPR48、PU.1、TRAF6、NFATc1、c-fos和c-Src表达均出现显著变化，说明患T2DM后显著促进各细胞因子表达从而促进破骨细胞分化。各细胞因子表达上调与破骨细胞数量增加存在密切关系，因细胞因子的表达上调使得分化产生的破骨细胞数量显著增多。Miyazaki等也发现当破骨细胞分化产生的数量增多时，TRAF6、NFATc1、c-fos、c-Jun和PU.1等细胞因子表达均出现显著变化。这可能与本研究中GPR48表达受到显著抑制有关。本实验室的前期研究发现，当敲除GPR48后破骨细胞分化受到显著促进，且破骨细胞中的相关调控因子（如TRAF6、NFATc1等）表达均显著上调。也可能与本研究中OPG／RANKL／RANK分子轴及其下游CN／NFAT信号通路的表达被激活有关。Song等研究证实，激活OPG／RANKL／RANK分子轴可显著促进破骨细胞分化及TRAF6、NFATc1、PU.1等调控破骨细胞分化的细胞因子表达。Zeng等研究也发现，RANKL可通过抑制NF-κB和激活NFATc1和DC-STAMP来促进RAW264.7细胞向破骨细胞的分化。破骨细胞分化增加及相关细胞因子表达上调可能与T2DM可激活PI3K／Akt信号通路有关。高岩等研究发现，PI3K、Akt和NF-κB等细胞因子表达与T2DM骨质疏松的发生存在密切的关系。
5.T2DM对小鼠破骨细胞分化的影响
破骨细胞是骨中最重要的细胞之一，主导着骨吸收代谢。破骨细胞与成骨细胞为骨中最重要的两种细胞，它们在功能上虽然相反，但是两者之间又存在着密切的生物学调控关系。破骨细胞主要由造血干细胞分化产生，形态上呈现由多个单核细胞融合形成的多核细胞，在一定程度上核的数量越多表明其骨吸收能力越强。研究发现，破骨细胞分化受到很多因素影响，而T2DM使得骨新陈代谢出现紊乱，骨吸收代谢显著增强。目前，国外有关T2DM影响破骨细胞分化的相关研究鲜有报道。国内马剑侠等研究发现，T2DM大鼠骨髓造血干细胞分化产生的破骨细胞数量显著增多。王燕在其博士学位论文中表述，体外培养的T2DM大鼠破骨细胞数量显著增多。国内有关T2DM破骨细胞分化及骨吸收功能的相关研究较多，均证实T2DM可显著促进破骨细胞分化并使得其数量显著增多。
在本研究中，T2DM造模成功8周后，取小鼠造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）进行原代培养，并利用M-CSF和RANKL诱导其向破骨细胞分化，然后进行TRAP染色。发现与ZC组相比，TC组小鼠分化产生的破骨细胞数量显著增多且大于10个核的单个细胞也显著增多，这与前人研究结果相一致。说明T2DM可造成小鼠机体内分化产生破骨细胞显著增多。这与T2DM使得骨组织出现骨质疏松或者骨折存在着密切的关系，因为当破骨细胞数量和单个细胞内细胞核数量增多时，骨吸收功能会出现显著增强。分析其生物学机制，与T2DM血糖高有关。许娟研究发现，高糖通过促进RANKL诱导NFATc1、c-fos等细胞因子表达，从而使得调控破骨细胞介导因子破骨细胞质子泵亚单位（v-ATPase VOsubunit d2，Atp6v Od2）、树突状细胞特异性跨膜蛋白（DC-STAMP）等的表达，促进破骨细胞的分化产生、成熟、活化以及多个破骨细胞的融核效应，进而促进骨吸收代谢。也可能与T2DM促进NF-κB、m TOR等细胞因子高表达有关。因当NF-κB、m TOR等细胞因子高表达时，会促进破骨细胞的分化、成熟、活化以及多核化等。而OPG／RANKL／RANK分子轴介导的CN／NFAT信号通路在破骨细胞分化成熟以及骨吸收代谢中也扮演着重要角色，患T2DM后骨组织中OPG／RANKL／RANK分子轴各分子表达显著上调，并激活其下游的CN／NFAT信号通路，促进了破骨细胞的分化、成熟、活化以及多核化。还可能与本研究中T2DM下调骨中GPR48表达有关。Luo等在研究GPR48全身基因敲除小鼠骨生长发育时发现，GPR48基因缺失抑制成骨细胞的分化，降低骨形成代谢。Anna等的研究发现，成骨细胞和破骨细胞之间是相互作用的，当分化产生的成骨细胞减少时而分化产生的破骨细胞数量却增多。
6.T2DM对小鼠骨吸收能力的影响
TRAP是酸性磷酸酶的第5类同工酶，由破骨细胞分泌产生，是评价骨吸收的最重要生化标志物之一。当TRAP活性增强时，骨组织中的Ⅰ型胶原蛋白等有机质分解会显著增加，从而使得骨矿物质缺少沉积场所，骨量和骨密度出现显著下降。患T2DM后由于机体内低胰岛素浓度和高血糖的内环境，使得机体代谢平衡被打破，从而导致一系列骨相关疾病发生，如骨质疏松症以及由骨质疏松引起的骨折等。目前国内外有关T2DM影响骨吸收代谢的研究较多，无论是人体还是动物研究均证实，长时间患T2DM后，骨量和骨密度都会出现显著下降。研究证实，T2DM小鼠骨组织中TRAP表达显著升高的同时伴随着股骨松质骨骨组织形态结构的显著下降。本研究中，T2DM小鼠造模成功8周后，利用TRAP染色对小鼠股骨和颅骨进行染色，与ZC组相比，TC组小鼠的TRAP活性显著升高，说明T2DM使得小鼠的骨吸收能力显著升高。究其原因，与T2DM使得小鼠机体内由造血干细胞分化产生的破骨细胞显著增多且存在密切的关系。研究证实，TRAP主要由破骨细胞分泌产生，且T2DM使得小鼠分化产生的破骨细胞显著增多，骨组织中TRAP活性显著提高，骨吸收能力显著增强。