一、材料与方法
1.实验动物
同本章第一节所述的实验动物。
2.实验动物造模
同本章第一节所述的实验动物造模。
3.实验动物干预
同本章第一节所述的实验动物干预。
4.实验用的主要试剂和仪器
表3-18和表3-19所示为实验所需的主要试剂和仪器。
表3-18 实验所需的主要试剂
续 表
表3-19 实验所需的主要仪器
续 表
5.主要试剂的配制
（1）TRAP染液：小鼠颅骨和造血干细胞诱导分化产生的破骨细胞的TRAP染色所需TRAP染液按照表3-20中的比例进行配制。
注意事项：实验所需TRAP染液要现用现配，并提前估算好所需要的TRAP体积，以免浪费。
（2）其他所用试剂配制方法均同本章第二节。
表3-20 TRAP染液配制所需试剂(https://www.daowen.com)
注：fast garnet GBC solution为石榴红硫酸溶液；sodtum nitritesolution为亚硝酸钠溶液；dd
O为双蒸水；naptholAS-B1 phosphatesolution为萘酚AS-BI磷酸盐溶液；acetate solution为醋酸盐溶液；tartrate solution为酒石酸溶液。
6.实验指标检测
（1）小鼠骨组织中骨吸收相关因子mRNA表达检测：胫骨和股骨中RNA提取（具体实验步骤同本章第二节）；RNA反转为cDNA（具体实验步骤同本章第二节）；骨中相关细胞因子mRNA表达的定量检测（具体实验步骤同本章第二节）。引物序列如表3-21所示。
表3-21 引物序列一览表
续 表
注：OPG为骨保护素；RANKL为核因子κB受体活化因子配体；TRAF6为泛素连接酶；Src为非受体酪氨酸激酶c；PLC为磷脂酶C；CN为钙调磷酸酶；NFATc为活化t-细胞核因子；β-actin为β-肌动蛋白；AP-1为激活蛋白-1；c-fos为原癌基因；TRAP为抗酒石酸酸性磷酸酶；CTSK为组织蛋白酶K；Cath K为小鼠组织蛋白酶K。
（2）IP3和Ca2＋浓度检测：取小鼠右侧前肢骨（去除上面软组织），将前肢骨用剪刀剪碎后研磨，然后按照IP3酶联免疫试剂盒步骤要求检测IP3浓度。具体步骤：在测试前要准备好1×PBS、ddH2 O等。先稀释抗体和血清样本，然后按照试剂盒内所带有的标准步骤进行IP3和Ca2＋的浓度检测（每个样要做一个副孔），利用酶标仪对酶标板的每个孔的吸光值（在450 nm波长处读数）进行检测。（注：在37℃孵育、读数等时候一定要注意避光；先做标准曲线，然后按照标准曲线计算每个检测孔的IP3和Ca2＋浓度）
（3）T2DM小鼠骨中相关蛋白表达检测：相关试剂配制和实验步骤与本章第二节一致，Ⅰ抗稀释如表3-22所示。
表3-22 Ⅰ抗稀释倍数及生产厂家
注：RANK为NF-κB活化受体因子；RANKL为核因子κB受体活化因子配体；c-fos为原癌基因；c-Src为细胞癌基因；TRAF6为泛素连接酶。
（4）破骨细胞TRAP染色：①实验前期准备。无菌操作台中需要准备移液管、10 mL和1 mL注射器、15 mL离心管、35 mm培养皿、α-MEM、小牛血清、双抗、完全培养基、灭菌手术器械等。无菌操作台外需要准备75%酒精、手术器械、纱布等。②实验具体步骤：断颈椎处死小鼠后，将小鼠置于75%酒精中浸泡2 min，进行灭菌。取小鼠后肢骨，去除上面肌肉等软组织并用纱布擦干净。然后将小鼠后肢骨转移到无菌操作台上。每组小鼠后肢骨先分别在75%酒精中浸泡2～3 min后，装于不同的培养皿中（皿中装有已灭菌的PBS），各清洗2遍。利用已灭菌的剪刀剪除股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔，利用10 mL注射器吸10 mLα-MEM，并配1 mL针头，将股骨和胫骨骨髓腔中的骨髓冲到的15 mL的离心管中。四组小鼠骨髓分别冲洗完毕后，摇动离心管欲将细胞冲打成单细胞悬液。完毕后，于离心机中按照800次／min×5 min进行离心，离心结束后吸除上层液体（保留底层细胞），加1 mLα-MEM重悬细胞（进行反复冲打，以便让细胞变成单细胞悬液），加2 mL红细胞裂解液，裂解细胞约1 min后加3 mL培养基（带血清），混匀。以800次／min、离心5 min，结束后加1 mL培养基（加M-CSF）进行重悬。将重悬的细胞加到6 cm的培养皿中并将培养基（加M-CSF）补到3 mL，置于温度为37℃和5%CO2浓度的培养箱中。24 h后，取上清漂浮细胞接于另一6 cm培养皿中，培养24 h后吸除上层培养基，利用Versene对贴壁细胞进行消化，待近1／3细胞漂浮起来加与消化液同等体积的完全培养基终止消化，以800次／min离心5 min后去除上层液体，加1 mL培养基重悬细胞，利用血细胞计数板对计数每组的细胞数。计数后按照30 000个／孔接于48孔板中，置于培养箱中24 h后，培养基中加入M-CSF和RANKL诱导BMM向破骨细胞分化（分为两批：一批用于提取破骨细胞的RNA；另一批用于TRAP染色），每隔2天换液1次，于第5天终止分化。其中一批提取破骨细胞的RNA并进行反转录，采用RT-PCR计数检测破骨细胞中的相关细胞因子RNA表达；另一批吸除培养基后，用4%PFA固定，固定后用TRAP染液染色破骨细胞，再用相机和显微镜分别拍照。
（5）小鼠颅骨TRAP活性检测：小鼠摘除眼球取血后断颈椎处死，取颅骨（剥除颅骨上肌肉等软组织，尤其要将其外表面和内表面上的骨膜剔干净），PBS清洗后，置于4%多聚甲醛中于4℃冰箱中固定24 h。固定后采用0.1%Triton-X100于温度为4℃的冰箱中透化24 h，透化结束后用PBST于4℃环境中处理24 h，再配制TRAP染液（具体配置见表3-21），将处理后的颅骨置于TRAP染液中在37℃环境中进行染色。染色结束后用数码相机拍照。
（6）小鼠股骨TRAP染色：小鼠断颈椎处死后取左侧后肢骨，剔除肌肉等软组织。采用4%PFA固定24～36 h，PBS清洗后用1%EDTA对骨组织进行脱钙处理，一般为14 d，中间换液一次（直至骨组织变软为止）。脱钙结束后，用双蒸水对骨组织进行清洗（每次2 min，共10次；如果EDTA脱钙不充分会影响后续的染色）。清洗结束后在PBS中浸泡2～3 h，然后按照50%（2 h）、75%（2 h）、85%（2 h）、95%（2 h）、95%（4℃过夜）、100%（4 h）进行酒精梯度脱水，脱水结束后按照酒精与二甲苯1∶1的比例（2 h）、二甲苯Ⅰ（2 h）和二甲苯Ⅱ（2 h）进行透化（因为骨组织较为致密，可延长透化时间利于进蜡），透化结束后按照1号蜡5 h、2号蜡过夜、3号蜡5 h（3号的浸蜡时间可延长）进行骨组织浸蜡。浸蜡结束后对骨组织进行石蜡包埋，然后修片，用切片机以6μm厚度进行切片，以62℃烤片2 h，然后在37℃条件下过夜（防止脱片）。过夜后切片置于常温或4℃冰箱中保存。
切片置于65℃烤片机上复烤30 min，然后按照二甲苯Ⅰ、Ⅱ以及100%、95%、85%、75%、50%酒精进行脱蜡和水化后，利用0.1%的Triton-X100（15 min）和PBST（10 min）进行处理后，利用TRAP染液染色。染色结束后用中性树脂进行封片，再用显微镜拍照。
7.数据统计
采用Excel、GraphPad Prism 5和SPSS18.0对检测数据进行统计，并进行单因素方差分析。P＜0.05和P＜0.01分别表示差异具有显著性和差异具有非常显著性。