运动对T2DM小鼠骨中JAK2／STAT3途径及骨吸收代谢作用的影响
当骨髓巨噬细胞分化产生的破骨细胞及融核后多核破骨细胞数目及活性异常增高时，骨吸收代谢显著升高，导致骨质疏松发生。T2DM破骨细胞分化及骨吸收能力显著增高，导致骨组织微细结构退化和骨密度（BMD）下降。该过程受众多信号通路调控，如酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）／信号转导子和转录激活子3（STAT3）途径等。研究发现，JAK2／STAT3途径参与调控细胞增殖、分化及凋亡等，并且介导破骨细胞分化、融核和骨吸收能力。JAK2是酪氨酸激酶的Janus家族一员，外部刺激诱导JAK受体的聚合反应并引起Tyr350位点的交互磷酸化，活化JAK能磷酸化STAT3结构域SH2中的酪氨酸残基，并通过酪氨酸-磷酸化活化T细胞核因子c1（activated T nuclear factor c1，NFATc1）及下游靶基因c-fos、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）、CTSK等表达。在利用高糖环境模拟T2DM并探究其对RAW264.7细胞分化影响时，发现JAK2表达上调后磷酸化STAT3进而促进RAW264.7向破骨细胞分化、融核。但生命医学领域内，有关JAK2／STAT3途径介导T2DM小鼠破骨细胞分化和骨吸收代谢的相关研究亟待补充。
运动是改善骨吸收代谢的重要手段，其可显著抑制T2DM的破骨细胞分化及骨吸收。然而，因运动中对骨产生的力学刺激（分为地面反作用力和肌肉牵拉力）不同，发现地面反作用力抑制骨吸收的作用优于肌肉牵拉力。然而，有关JAK2／STAT3途径在不同力学刺激影响T2DM小鼠破骨细胞分化及骨吸收中作用机制的相关研究尚待补充。由此，本研究拟利用下坡跑和游泳对T2DM小鼠进行运动干预并用于模拟对骨组织产生的地面反作用力和肌肉牵拉力。利用Western-blotting、RT-PCR、破骨细胞原代培养等技术，从基因表达、细胞分化及功能变化、骨表型等不同层面探究JAK2／STAT3途径在不同力学刺激抑制T2DM小鼠破骨细胞分化及骨吸收代谢中的作用机制。
1.材料与方法
1）实验动物的造模与分组
4周龄雄性C57BL／6小鼠，由上海西普尔-必凯公司提供。小鼠分笼饲养，自然光照，适应一周后，随机分为正常对照组（ZC，10只）和T2DM建模组（TJ，30只）。采用6周高脂膳食结合注射链脲佐菌素（STZ，6周高脂膳食结束后仅注射一次，标准为80 mg／kg）进行T2DM小鼠造模，ZC组小鼠按同等标准注射柠檬酸-柠檬酸钠溶液。STZ注射结束两周后测量T2DM造模组空腹12 h后血糖浓度，血糖浓度≥8 mmol／L的为T2DM小鼠，结果显示27只小鼠造模成功，并随机平均分为T2DM对照组（TC，9只）、T2DM游泳组（TS，9只）和T2DM下坡跑组（TD，9只）。TC组、TS组和TD组继续给予高脂膳食，ZC组给予普通饲料。
2）实验动物训练方案
对TS组和TD组小鼠进行游泳和下坡跑训练，每次50 min、每周6天、共8周。第一周进行适应性训练，具体安排如下：第1～2天为每次30 min，第3～4天为每次40 min，第5～6天为每次50 min。游泳采用42 cm（长）×40 cm（宽）×36 cm（深）的容器；下坡跑的速率为0.8 km／h，坡度为—9°角。
3）实验动物取材
8周运动干预结束后的24～48 h内，处死四组小鼠并进行相应取材，具体如下：取小鼠右侧后肢骨的股骨和胫骨（利用纱布剔除肌肉等软组织），PBS清洗后保存于—80℃冰箱，以备用于RT-PCR和Western-blotting检测；取小鼠BMM用于细胞原代培养，并利用M-CSF和RANKL诱导其向破骨细胞分化，进行TRAP染色；取分化产生的破骨细胞，利用RT-PCR检测相关因子mRNA表达；取后肢左侧胫骨，以备利用石蜡切片和TRAP染液检测TRAP活性；取左侧股骨（剔除肌肉等软组织），PBS清洗后置于—80℃冰箱保存，以备用于micro-CT检测股骨远端BMD变化。
4）指标检测
（1）骨和破骨细胞中相关因子mRNA表达检测：取超低温保存右侧股骨（利用PBS进行清洗）和Trizol裂解破骨细胞，利用Trizol法提取RNA。按照Takara反转试剂盒标准步骤将RNA反转为cDNA，稀释后按25μL体系对JAK2／STAT3途径和破骨细胞中相关因子进行定量检测。引物序列是利用Primer premer软件进行设计（见表4-27），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并检测引物特异性。
表4-27 引物序列
续 表
表中：NFATcl为活化T细胞核因子c1；c-fos为原癌基因；TRAP为抗酒石酸酸性磷酸酶；CTSK为组织蛋白酶K；β-actin为β-肌动蛋白；PU.1为Spi-1原致肿瘤基因；c-src为酪氨酸激酶；JAK2为酪氨酸蛋白激酶2；STAT3为信号转导子和转录激活子3。
（2）小鼠骨中相关因子蛋白表达检测：利用Western-blotting技术检测相关因子蛋白表达，取小鼠右侧胫骨，进行研磨提取蛋白，并检测蛋白浓度，利用PBS将浓度调到一致，进行变性、电泳、转膜和Ⅰ、Ⅱ抗孵育，最后一次TBST洗膜后，利用Alpha凝胶成像系统对PVDF膜进行显影、拍照并利用Fluor Chem FC2软件进行行数据分析。
（3）BMM分化产生破骨细胞的骨吸收能力检测：断颈椎处死小鼠并用75%酒精灭菌2 min，取小鼠四肢骨（去除肌肉等软组织）。于超净台中，剪除股两端暴露骨髓腔，并利用吸有α-MEM的注射器将骨髓吹出，制备单细胞悬液，以800次／min、离心5 min，重悬后加红细胞裂解液再次离心后加1 mL培养基（含M-CSF）重悬。然后将细胞转移至6 cm培养皿中并补到3 mL，置培养箱中培养24 h后去上清，对贴壁细胞进行消化、计数。按3万细胞标准接于48孔板中，培养24 h后利用M-CSF和RANKL诱导BMM向破骨细胞分化。利用TRAP染液对分化至第5天且已用4%PFA固定的破骨细胞进行染色，利用Leica显微镜拍照并利用Blindness法进行计数。
（4）股骨TRAP染色：取小鼠股骨，用4%的PFA进行24～36 h固定，PBS清洗后进行为期14天的脱钙，脱钙结束后，利用双蒸水进行清洗，PBS浸泡2 h后，进行酒精梯度脱水、透化、浸蜡、包埋、切片、复烤、脱蜡、水化，然后利用0.1%的Triton-X100和PBST分别进行5 min和10 min的处理，结束后用TRAP染液进行染色并用显微镜拍照。
（5）小鼠股骨远端骨密度（BMD）检测：取右侧股骨，PBS清洗后用4%PFA固定24 h，PBS再次清洗后置于75%酒精中保存，利用Skyscan Micro-CT系统（按18μm／帧标准）对股骨远端进行扫描。结束后，采用micro-CT软件对松质骨BMD进行分析。
6）数据统计
利用Excel和SPSS20.0对数据进行统计分析，ZC组和TC组行独立样本T检验，TC组、TS组和TD组行单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2.研究结果
1）不同运动对T2DM小鼠骨中相关因子mRNA表达的影响
由表4-28可知，与ZC组相比，TC组JAK2 mRNA表达显著下调，STAT3、NFATc1、CTSK和c-fos mRNA表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01）。与TC组相比，TS组CTSK mRNA表达显著下调（P＜0.05），JAK2、STAT3、NFATc1和c-fos mRNA表达呈下调趋势但差异不具有显著性（P＞0.05）；TD组JAK2 mRNA表达显著上调（P＜0.01），STAT3、NFATc1、CTSK和c-fos mRNA表达均显著下调（P＜0.05）。与TS组相比，TD组JAK2 mRNA表达显著上调（P＜0.05），而STAT3、NFATc1、CTSK和c-fos mRNA表达均显著下调（P＜0.05）。
表4-28 各组小鼠骨中相关因子mRNA表达变化（
）
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05。
2）不同运动对T2DM小鼠骨中相关因子蛋白表达的影响
由图4-26和表4-29可知：与ZC组相比，TC组NFATc1、CTSK和cfos蛋白表达明显上调（P＜0.01）。与TC组相比，TS组NFATc1蛋白表达显著下调（P＜0.05），但CTSK和c-fos蛋白表达呈下调趋势但差异不具显著性（P＞0.05）；TD组NFATc1、CTSK和c-fos蛋白表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。与TS组相比，TD组NFATc1、CTSK和c-fos蛋白表达亦显著下调（P＜0.05）。
图4-26 各组小鼠骨中蛋白表达变化示意图
表4-29 各组小鼠骨中相关因子蛋白表达变化（
）(https://www.daowen.com)
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05。
3）不同运动对T2DM小鼠分化产生破骨细胞的影响
多核破骨细胞是指细胞核经融核后形成的不少于3个核的破骨细胞，由图4-27和表4-30可知：与ZC组相比，TC组破骨细胞数量和多核破骨细胞（指≥3个核的破骨细胞）数量均显著增多（P＜0.01）。与TC组相比，TS组破骨细胞数量和多核破骨细胞数量呈减少趋势但差异不具有显著性（P＞0.05）；TD组破骨细胞数量和多核破骨细胞数量均显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。与TS组相比，TD组破骨细胞数量和多核破骨细胞数量均明显减少（P＜0.05）。
图4-27 运动影响T2DM小鼠破骨细胞分化示意图
表4-30 各组小鼠分化产生破骨细胞数量变化（
）
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05。
4）不同运动对T2DM小鼠分化产生破骨细胞中相关因子mRNA表达的影响
由表4-31可知：与ZC组相比，TC组TRAP、NFATc1、PU.1、c-fos（P＜0.01）和c-Src mRNA表达均显著上调（P＜0.01）。与TC组相比，TS组c-fos mRNA表达显著下调（P＜0.05），而NFATc1、TRAP、PU.1和c-Src mRNA表达呈下调趋势但差异不具有显著性（P＞0.05）；TD组TRAP、NFATc1、PU.1、c-fos和c-Src mRNA表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。与TS组相比，TD组TRAP、NFATc1、PU.1、c-fos和c-Src mRNA的表达亦均明显下调（P＜0.05）。
表4-31 各组小鼠分化产生破骨细胞中相关因子mRNA表达变化（
）
续 表
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05。
5）不同运动对T2DM小鼠骨组织TRAP活性的影响
TRAP染液可与骨骺线处破骨细胞分泌的TRAP结合并呈紫红色，颜色越强表示TRAP活性越强，颜色越弱表示TRAP活性越弱。由图4-28可见：与ZC组相比，TC组股骨骺线处TRAP活性显著增强。与TC组相比，TS组TRAP活性下降不显著；TD组TRAP活性显著下降。与TS组相比，TD组TRAP活性明显下降。
6）不同运动对T2DM小鼠BMD的影响
图4-28 运动影响T2DM小鼠骨TRAP的活性示
图A为切片TRAP染色后于骨骺线处4X拍照；图B为切片TRAP染色后于骨骺线处局部10X镜下拍照。
分析表4-32可知，与ZC组相比，TC组BMD（P＜0.01）显著降低。与TC组相比，TS组BMD（P＞0.05）增加不显著，而TD组BMD（P＜0.01）显著升高。TS组和TD组BMD（P＞0.05）比较发现差异不具有显著性。
表4-32 各组小鼠股骨远端松质骨BMD变化（
）
注：与TC组相比，**P＜0.01。
3.讨论分析
骨稳态是成骨细胞形成新骨且破骨细胞吸收旧骨的动态平衡过程，当骨吸收异常升高引起代谢失衡时将导致骨量丢失和骨组织微细结构退化，引发骨质疏松。而破骨细胞由BMM分化产生，T2DM机体内的能量代谢紊乱、氧化应激、炎症反应等导致破骨细胞分化、融核及骨吸收功能异常增高，骨稳态失衡，骨表型呈现骨组织形态结构退化、BMD下降等表征，并首先表现在松质骨。在利用瘦素缺陷型小鼠作为T2DM模型探究创伤后异位骨化的病理发展时，发现其异位骨化中心骨吸收增强与分化产生的破骨细胞数量及骨吸收功能显著升高密切相关。本研究中，与ZC组相比，TC组小鼠BMD显著下降。表明T2DM小鼠骨量出现显著下降，出现骨质疏松。这与本研究中T2DM小鼠分化产生的破骨细胞和多核破骨细胞数量显著增多，进而引起骨吸收异常升高密切相关。当破骨细胞骨吸收能力增强后，导致T2DM小鼠股骨远端骺线处TRAP（骨吸收生化标志物）活性升高。并且，此过程受关键因子调控，如NFATc1、转录因子PU.1［spleen focus-forming virus（SFFV）proviral integration 1］等。本研究中，诱导BMM分化产生破骨细胞过程中NFATc1、PU.1、c-fos和c-Src的mRNA表达均显著上调。这在一定程度上从分子层面揭示了T2DM促进破骨细胞分化及融核的生物机制，因核内基因NFATc1活化后可激活下游PU.1、cfos、c-Src和TRAP的级联反应，从而促进BMM向破骨细胞前体细胞和成熟破骨细胞分化以及后期的多个破骨细胞融核。破骨细胞和多核破骨细胞显著增多导致蚀骨作用显著增强，造成骨组织微细结构退化和骨量流失，引发骨质疏松。信号网络作为调控骨代谢的深层机制，其在调节破骨细胞分化及骨吸收中亦不可少。JAK2／STAT3信号通路作为调节细胞增殖、分化和凋亡过程中的重要途径，但有关其调控T2DM小鼠骨吸收代谢的相关研究亟待补充。本研究中，与ZC组相比，TC组JAK2 mRNA表达下调，STAT3、NFATc1、PU.1、组织蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）和c-fos mRNA表达均上调，表明T2DM小鼠骨中JAK2／STAT3信号通路被激活。分析原因，T2DM小鼠骨中炎性因子（如IL-20和IL-24等）与其受体结合后会激活JAK2，活化的JAK2激酶磷酸化gp130胞内侧的络氨酸残基，招募并活化信号转导与STAT3，进而激活RANKL的基因转录从而导致成纤维细胞样滑膜细胞（fibroblast-like synovial cells，FLS）大量表达RANKL，进而调控破骨细胞分化、融核。RANKL是破骨细胞分化过程中的必需细胞因子，它与核因子κB受体激活因子（nuclear factor κB，RANK）相互作用以调节核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB），丝裂原活化蛋白酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和破骨细胞中的钙信号转导，然后调控JAK2／STAT3信号通路及其靶基因NFATc1、c-fos和CTSK表达，调控破骨细胞介导骨吸收。
运动中，肌肉收缩产生的张力刺激和地面对骨产生的反作用力可调控成骨细胞和破骨细胞主导的骨形成和骨吸收，改善骨组织微细结构和BMD，且不同力学刺激对骨代谢，尤其是骨吸收产生的作用效果亦是不同。下坡跑作为一离心运动，运动中相较于肌肉牵拉力，骨受到的地面反作用力更大；游泳过程中因无地面接触，仅有肌肉牵拉力。运动改善骨代谢已成共识，并且首现于松质骨的骨组织微细结构，BMD退化是反映骨代谢紊乱的经典指标。T2DM因胰岛素抵抗、能量代谢紊乱等使骨吸收异常升高，导致股骨远端松质骨骨组织形态计量学指标、骨组织形态结构和BMD等显著退化，而8周跑台运动可显著改善以上骨表型指标。经过8周运动后，T2DM小鼠股骨远端BMD显著升高，且下坡跑对骨组织产生的地面反作用力在增加BMD上的作用显著优于游泳产生的肌肉牵拉力，这与前人研究结果相一致。分析其机制，与下坡跑对T2DM小鼠骨产生的地面反作用力显著促进其成骨细胞分化及其活性有关，当其活性升高后促进骨形成，增加BMD。分化产生的破骨细胞和多核破骨细胞增多是T2DM小鼠BMD下降的另一主因。本研究中，与游泳运动对骨产生的肌肉牵拉力相比，下坡跑产生的地面反作用力可显著抑制T2DM小鼠破骨细胞分化、融核。以上结果变化不仅揭示了本研究中TS和TD两组的BMD变化，也解释了两组小鼠股骨远端骺线处的TRAP活性变化。并且，关键细胞因子介导运动抑制破骨细胞分化和骨吸收。8周运动后，TS组破骨细胞中仅c-fos mRNA表达下调，而TD组TRAP、NFATc1、PU.1、c-fos和c-Src mRNA表达均下调。并且与TS组相比，TD组众细胞因子mRNA表达均下调。表明，地面反作用力抑制T2DM小鼠分化产生的破骨细胞中TRAP等因子表达。NFATc1作为调控破骨细胞分化、成熟的特异性基因，NFATc1基因缺失胚胎干细胞在RANKL诱导下不能分化为破骨细胞。在力学刺激下，核内PU.1不能与NFATc1的N端启动子结合，表达下调后导致c-fos和c-Src均在色氨酸／羟胺酸位点失活，引起BMM数量减少并抑制其分化为破骨细胞。然而，作为NFATc1靶基因的TRAP是破骨细胞标志基因，在分化及成熟破骨细胞中高表达，并调控骨吸收。
JAK2／STAT3途径通过激活T2DM小鼠骨中NFATc1及下游CTSK、cfos表达，促进破骨细胞分化、融核，导致骨质疏松发生。作为调控骨代谢重要手段的运动，可显著抑制T2DM的破骨细胞分化及骨吸收代谢，但是JAK2／STAT3途径在此过程中具有什么调控作用、扮演什么角色尚待研究证实。利用不同力学刺激对T2DM小鼠干预8周后，TS组仅CTSK mRNA和NFATc1蛋白表达下调，其他因子表达不显著，而TD组JAK2／STAT3途径相关因子mRNA和NFATc1、CTSK和c-fos蛋白表达均显著下调；并且，与TS组相比，TD组JAK2表达显著上调，其下游相关基因STAT3、NFATc1等mRNA和NFATc1、CTSK、c-fos蛋白表达均显著下调。表明，下坡跑显著抑制T2DM小鼠骨中JAK2／STAT3途径，而游泳却不能。分析其调控机制，与下坡跑对骨产生的较大强度地面反作用力影响T2DM小鼠骨中RANKL表达有关。当其被激活后与RANK结合，使其与下游肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAP6）结合，抑制JAK2／STAT3途径，使c-fos基因失活进而不能与NFATc1结合并抑制c-Src，抑制破骨细胞分化及融核。再者，力学刺激改善T2DM雄性激素表达，激活雄性激素受体SOCS3后磷酸化JAK2，活化JAK2能磷酸化细胞因子受体胞浆结构域中的酪氨酸残基，而募集含SH2结构域信号分子STAT3及下游NFATc1等靶基因。受限于相关研究较少，更多分子机制尚待揭示。
4.结论
下坡跑对骨产生的地面反作用力通过JAK2／STAT3途径抑制T2DM小鼠破骨细胞分化及骨吸收，增加骨量，而游泳对骨产生的肌肉牵拉力作用不明显。