表观遗传学在T2DM骨代谢中的作用机制

骨组织作为一个代谢活跃的器官，其重塑过程包括矿化骨的破坏、骨基质形成及矿化。近年来，已证明除了遗传、性别、生活习惯、体力活动等会影响骨代谢稳态外，表观遗传修饰在骨代谢平衡中也发挥重要作用，其主要机制为富含CpG的启动子中的DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。与遗传不同，表观遗传可以在不改变基因序列的前提下对基因表达进行调控进而影响骨代谢，这种方式灵活且可遗传，这种遗传过程主要由特定的DNA序列指纹图谱确定染色质景观以及由相关的表观遗传记忆因子组成，这些因子包括转录激活和抑制蛋白因子以及介导表观遗传转化和维持非编码RNA。参与该过程的已知和仍待识别的表观遗传记忆因子包括表观遗传记忆擦除因子、表观遗传记忆保护因子、表观遗传记忆启动因子、表观遗传记忆解码因子、表观遗传记忆中介因子和表观遗传记忆固定因子等，这些表观遗传记忆因子是构成独特的“表观基因组记忆体”的必要因子。

DNA甲基化是表观遗传调控最深入研究的机制。这种分子机制包括在胞嘧啶环的第5个位置添加一个甲基（-CH3）。DNA甲基化／去甲基化的过程主要发生在CpG岛（富含胞嘧啶的短基因组区域，随后是鸟嘌呤核苷酸）中，该区域通常位于基因启动子区域的转录起始位点附近。CpG岛的甲基化通常会导致转录沉默，尽管最近发现一些转录因子在发育过程中的细胞重编程中起着重要作用，它们倾向于与CpG甲基化序列结合。最近，在糖尿病患者中观察到胰腺，胰岛，脂肪组织，骨骼肌和肝脏等组织中DNA甲基化的显著改变，突显了这些过程在2型糖尿病（T2DM）发病机制中的作用。β细胞无法补偿胰岛素抵抗是T2DM发病机制的关键，并涉及β细胞同一性，功能和生存的逐步损害。β细胞稳态的这些方面受表观遗传机制控制，这表明由不利的代谢环境驱动的表观遗传变化可能会诱发β细胞衰竭。其中DNA甲基化正是在遗传-环境-骨质变化范畴内，由基因和外界环境的相互作用，引起生命周期内骨质改变的表观遗传调控方式之一，它通过抑制决定β细胞中转录因子Arx的α细胞谱系的表达来调节α对β细胞的分泌。DNA甲基转移酶1（Dnmt1）在β细胞复制过程中保持Arx基因座的甲基化和阻遏状态。因此，β细胞中Dnmt1的缺失会由于启动子去甲基化而导致Arx表达的诱导，从而驱动β细胞向α细胞的反式分化。DNA甲基化还有助于建立代谢过程，该过程允许在出生后的β细胞中向功能成熟的β细胞表型建立葡萄糖刺激的胰岛素分泌（glucose-stimulate insulin secretion，GSIS）。

DNA甲基化可发生在早期胚胎发育过程中调节细胞特性和基因组稳定性的基因座中。其中，核心结合因子2极易受DNA甲基化影响，仅转录起始位点上游0.6 kb的序列就足以驱动核心结合因子2 P1启动子活性，在特定CpG位点去甲基化后，核心结合因子2过表达会显著提高未甲基化的基质金属蛋白酶13基因活性，增加深层软骨细胞中蛋白降解酶水平，在T2DM患者体内核心结合因子2表达水平较高，激活基质金属蛋白酶13基因，最终导致骨关节炎产生。骨硬化蛋白是由骨细胞通过旁分泌作用于成骨细胞的功能蛋白，对骨组织具有高度选择性，骨质疏松患者血浆骨硬化蛋白甲基化阳性率显著低于无骨质疏松者，且前者骨硬化蛋白mRNA相对表达量明显高于后者，T2DM易引起骨硬化蛋白基因甲基化异常，从而引发骨质疏松。此外，因T2DM造成股骨头坏死患者的间充质干细胞中Wnt受体Frizzled1基因转录水平较低，同时伴有Fizzled1基因启动子异常高甲基化，这使得Wnt／β-catenin信号通路功能被抑制并直接影响间充质干细胞成骨分化及骨形成。总之，与骨形成相关的多个基因及信号通路受DNA甲基化调控且它们之间存在交互影响，共同作用调节骨形成。在骨吸收过程中，DNA甲基转移酶3a介导SAM发生的DNA甲基化可通过抗破骨细胞生成基因的表观遗传抑制来调节破骨细胞生产，T2DM的发生促进DNA甲基转移酶3a分化。IRF8是调控破骨细胞分化的关键负性调节因子，DNA甲基转移酶3a通过其自身生物学作用提高IRF8远侧调节元件甲基化从而抑制其发挥作用，促进破骨细胞分化，当破骨细胞中DNA甲基转移酶3a特异性缺失或使用DNA甲基转移酶3a抑制剂处理均会减少骨丢失。在对多发性骨髓瘤患者的研究中发现，多发性骨髓瘤分泌的胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）可上调IRF8甲基化并抑制其表达，从而减弱对破骨细胞分化的负性调节作用并促进骨吸收过程，而这直接导致多发性骨髓瘤患者产生溶骨性改变。OPG／RANKL／RANK通路在调节骨代谢中也受到DNA甲基化影响，T2DM患者骨中OPG／RANKL／RANK通路受高糖内环境影响被激活。对高同型半胱氨酸血症导致骨丢失而形成骨质疏松的小鼠进行研究发现，机体在高同型半胱氨酸血症条件下，DNA甲基转移酶1表达升高，活化后的c-Jun氨基末端激酶与DNA甲基转移酶1启动子结合使骨保护素出现超甲基化，在抑制骨保护素转录的同时促进RANKL表达激活，最终加速破骨细胞形成及骨吸收，易产生骨质疏松。另一项研究发现，T2DM骨中诱导分化的骨髓间充质干细胞（BMSCs）中RANKL基因启动子附近的CpG出现甲基化，导致基因沉默并抑制RANKL表达，使用5-氮胞苷处理高甲基化的HEK-293细胞后，发现RANKL和骨保护素表达明显上调，这会影响破骨细胞形成从而导致骨稳态失衡。

核心组蛋白的翻译后修饰，包括组蛋白尾巴的乙酰化，甲基化，泛素化，磷酸化和SUMO化，是表观遗传调控的另一个关键机制。特别是组蛋白乙酰化与转录基因活性有关，而组蛋白去乙酰化则允许DNA与组蛋白尾巴之间相互作用，并导致染色质紧缩和转录沉默，标记功能染色质单位的组蛋白修饰的各种组合形成所谓的“组蛋白密码”。因此，募集了一些调节基因活性和染色质结构的共激活因子、共抑制因子和转录因子。组蛋白修饰通过两种主要机制影响转录活性。第一个机制是通过修饰染色质的结构和构象，第二个机制是通过提供具有特定酶活性的特定蛋白质和复合物的信号来募集转录阻遏物或激活物。组蛋白修饰的动态“书写”或“擦除”可以通过特定的酶来实现，该酶催化去除或添加乙酰基到组蛋白N末端尾巴上赖氨酸残基上的过程。主要的“书写者”包括组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）和组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase，HMT），而“擦除者”包括组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase，HDAC）和赖氨酸脱甲基酶（lysine demethylase，KDM）。DNA甲基化和组蛋白修饰彼此紧密相关，DNA甲基化会共同影响染色质对RNA聚合酶和转录因子的可及性，从而影响组蛋白修饰，反之亦然。(https://www.daowen.com)

根据其对酵母蛋白的同源性可分为5类（Ⅰ类、Ⅱa类、Ⅱb类、Ⅲ类和Ⅳ类），与成骨分化相关的主要是Ⅰ类HDAC（HDAC1／2／3／8）。T2DM患者体内高糖环境会引起HDAC1／3过表达，在破坏成骨细胞功能的同时诱导大量促炎性细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α和COX2等产生，激活NF-κB并活化破骨细胞，从而导致骨形成被破坏以及骨吸收增加。HDAC8与膜内成骨密切相关，可通过使H3K9脱乙酰并抑制核心结合因子2转录活性进而抑制BMSCs成骨分化。周华等通过体外培养大鼠BMSCs并转染HDAC8过表达慢病毒载体，成骨诱导7天后发现核心结合因子2、成骨细胞特异性转录因子OSX、骨桥蛋白、骨钙素等成骨干细胞对成骨分化具有抑制作用。Ⅱa类HDAC（HDAC4／5／7／9）特异性地表达于骨骼肌、骨骼、心肌等细胞中，可通过靶向Smad3来抑制核心结合因子2基因表达，并且与骨发育密切联系。其中HDAC7与HDAC3相似，可以通过去乙酰化方式抑制核心结合因子2活性进而影响成骨细胞矿化，而骨形态发生蛋白2可激活蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent protein kinases 1，CDK1），CDK1的激活会磷酸化HDAC7并使其游离出细胞核，从而保护核心结合因子2不被HDAC7抑制。但目前对HDAC7抑制核心结合因子2的机制研究还不清晰，仍有待研究。HDAC4的N端存在一个肌细胞增强因子2结合区，当其与肌细胞增强因子2结合以后会诱导HDAC4入核并乙酰化核心结合因子2特定位点赖氨酸残基，增加赖氨酸残基敏感性，这使得核心结合因子2更易受到Smad泛素化调节因子1降解，最终抑制核心结合因子2活性。Kim等研究发现，RANKL可以和组蛋白乙酰转移酶相互作用提高破骨细胞中NFATc1乙酰化水平并促进其表达，增加骨吸收，而过表达HDAC5可以降低NFATc1乙酰化水平，进一步使用HDAC抑制剂丁酸钠处理后，NFATc1乙酰化水平升高并促进破骨细胞分化，HDAC9作用机制与HDAC5相似，T2DM的发生促进RANKL分化，提高破骨细胞中NFATc1乙酰化水平。HDAC1和HDAC2可通过复合其他蛋白体来发挥作用，MS-275作为HDAC1的抑制剂可通过下调c-fos和NFATc1表达进而抑制破骨细胞形成，降低骨吸收，HDAC1／2抑制剂NW-21可以下调TRAP6和NFATc1进而减弱破骨细胞功能。另外一些非选择性HDAC抑制剂也表现出强烈的破骨细胞抑制作用，如1179.4b可以通过抑制TRAP6进而抑制c-fos来影响破骨细胞分化成熟，FR901228可以抑制NFATc1等。

表观遗传调控的另一个关键组成部分是通过非编码RNA对基因活性的控制，该非编码RNA在转录和转录后水平上均调控基因表达。有些调节性RNA分子从DNA序列转录而未翻译成蛋白质。几种非编码RNA可能通过RNA干扰（RNAi）机制干扰信使RNA（mRNA）分子，通过该机制可以以序列特异性方式调节基因表达而无须修饰靶序列。目前，microRNA（miRNA，18～25个核苷酸）的RNA分子可能在转录后水平上负调控靶基因的表达，是对表观遗传调控过程做出最全面研究的非编码RNA。越来越多的证据表明，miRNA在T2DM和相关心血管疾病（CVD）的发病机制中的重要性。每个miRNA都能控制多个mRNA，而每个miRNA可以被不同的miRNA靶向以精确控制各种细胞过程。因此，miRNA调控的信号通路可能异常复杂。

在过去研究中发现了大量与骨形成／骨吸收相关的miRNA。在小鼠MC3T3-E1中，miR-141和miR-200可通过靶向抑制远端缺失同源盒基因5来调节成骨细胞分化；Dickkopf同源物1是Wnt信号通路的可溶性胞外抑制剂，miR-335-5p通过与Dickkopf同源物1 mRNA 3′UTR结合下调Dickkopf同源物1表达，进而增加β-catenin的转录活性并促进成骨分化；miR-29a还可靶向HDAC4 3′UTR来维持核心结合因子2乙酰化水平，同时逆转HDAC4介导的β-catenin泛素化，促进成骨细胞分化并减少糖皮质激素诱导的骨量减少。T2DM患者骨中Dickkopf同源物1表达上调，抑制β-catenin活性，同时核心结合因子2乙酰化水平降低，HDAC4逆转量，减少成骨细胞分化。不同的miRNA对破骨细胞的作用不同，且其在T2DM骨细胞中的分泌水平不同。miR-218-5p和miR-124通过负调控NFATc1来抑制破骨细胞形成；而作用于NFATc1上游的miRNA-7-5p和微小RNA-26则通过抑制树突状细胞特异性跨膜蛋白来阻止破骨细胞成熟。与上述miRNA作用相反，另一部分微小RNA可以促进破骨细胞生成。miR-148a表达上升可以抑制NFATc1等破骨细胞促进因子的负调节因子，促进破骨细胞成熟，使用抑制剂特异性处理miR-148a后，骨吸收减弱，骨形成以及骨量增加；miR-214兼具抑制成骨细胞／促进破骨细胞分化的功能，可以与10号染色体缺失的磷酸酶基因的3′非编码区域结合，通过激活PI3K／AKT／NFATc1信号通路来促进破骨细胞分化。据此推测，非编码RNA对T2DM骨代谢有影响。