运动对T2DM小鼠骨中Notch途径及骨形成代谢作用的影响
T2DM因其升高的胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和血糖水平引发骨质疏松等并发症。成骨细胞由BMSCs分化产生，主导骨形成代谢，而其分化及骨形成能力紊乱是导致骨质疏松的主因。T2DM抑制BMSCs向成骨细胞分化及其骨形成能力，研究发现该过程受Notch等信号通路或关键分子调控。Notch是一条进化保守的途径，由Notch、DSL蛋白配体和DNA结合蛋白CSL等构成，调控动脉内皮细胞分化、细胞凋亡、自噬等重要生理过程，介导骨代谢。Notch1-4是单向跨膜蛋白受体，尤其Notch1可被Delta（DLL1／3／4）和Jagged／Serrate（JAG1／2）配体所激活，进而活化下游效应靶蛋白HES-1。引发蛋白质水解裂变并暴露Notch胞内区域（Notch intracellular region，NICD），从而入核与DNA结合调控成骨细胞分化及骨形成靶基因成骨特异性转录因子（runt-related transcription factor 2，Runx2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Osterix（Osx）等表达。在MC3T3-E1中，Notch途径激活后促进其向成骨细胞分化，并使成骨细胞中ALP、骨钙素（osteocalcin，OCN）等骨形成标志基因表达上调。在研究Notch途径调控斑马鱼成骨细胞分化时发现，该途径激活促进斑马鱼成骨细胞分化及骨形成标志基因Runx2、ALP等表达。并且，Notch途径（如Notch-DLL1途径）激活后上调胞内NICD基因表达，进而活化下游靶基因，促进成骨细胞分化。但是，生命医学领域内有关Notch途径调控T2DM成骨细胞分化或骨形成的相关研究尚待补充。
运动促进T2DM成骨细胞分化及骨形成，而运动对骨的直接作用力促骨形成效果显著优于间接作用力。其分子机制与激活T2DM小鼠骨中TGF-β／BMP、c AMP／CREB／Akt等信号通路有关。Notch为调节成骨细胞分化及骨形成的关键途径，在运动促进生长期小鼠成骨细胞分化及骨形成中具有重要调控作用。然而，有关不同运动方式激活T2DM小鼠骨中Notch途径进而促进成骨细胞分化及骨形成的相关研究尚待补充。基于此，本研究拟采用游泳和下坡跑分别对T2DM小鼠进行运动干预，利用micro-CT、细胞原代培养、Westernblotting等技术方法对骨表型、成骨细胞分化、基因表达等指标进行检测，探究Notch途径在运动促进T2DM小鼠成骨细胞分化及骨形成中的作用，为运动改善T2DM骨代谢的机制研究提供一定的理论依据和药物研发靶点。
1.材料与方法
1）实验动物及造模
4周龄雄性C57BL／6小鼠，共40只，购于上海西普尔-必凯公司。适应1周后，随机分为正常对照组（TC，n＝10只）和T2DM建模组（TJ，n＝30只）。TJ组小鼠采用6周高脂膳食和注射STZ（按80 mg／kg体重标准注射1次）进行造模，TC组注射同等浓度的柠檬酸-柠檬酸钠溶液。注射2周结束，以空腹12 h后，血糖浓度≥8 mmol／L为建模成功，并随机分为对照组（TC）、游泳组（TS）和下坡跑组（TD），每组9只。ZC组喂普通饲料，另外三组给予高脂膳食，自由饮水，自然光照。
2）运动干预方案
分别利用游泳和下坡跑两种方式运动对TS组和TD组小鼠进行干预，具体方案如下。游泳：第1周适应性训练，第1～2天训练30 min，第3～4天训练40 min，第5～6天训练50 min，第2周开始训练时间为每天50 min，共计8周。下坡跑：0.8 km／h，50 min，坡度为9°角，每周6天，共计8周（运动适应方案同游泳）。
3）取材
取小鼠左侧股骨（无软组织），以备micro-CT检测其远端松质骨和皮质骨BMD；取小鼠右侧股骨，利用石蜡切片和Van Gieson染色对股骨近端骨组织形态结构进行检测；取小鼠BMSCs并诱导成骨细胞分化，收集成骨细胞并利用RT-PCR检测其骨形成标志基因表达；取右侧胫骨以备RT-PCR和Westernblotting检测相关细胞因子mRNA和蛋白表达。
4）实验方法
（1）体重：用电子秤对8周训练结束后小鼠的体重进行称量。
（2）股骨BMD检测：右侧股骨经4%PFA固定24 h后，利用Skyscan Micro-CT系统（型号：1076）以18μm／帧标准进行扫描，并利用CT An软件对原始数据进行处理并得到BMD值。
（3）骨组织形态结构检测：股骨经4%PFA固定12 h后，用EDTA脱钙2次、每次7天，然后用酒精梯度脱水、浸蜡、包埋。以6μm厚度进行切片并烤片、脱蜡、复水后行Van Gieson染色。结束后，按标准步骤封片后，利用Leica显微镜进行拍照并利用Photoshop软件对骨骺位置进行截图。
（4）成骨细胞中骨形成标志基因表达检测：按标准步骤诱导各组小鼠BMSCs向成骨细胞分化，各分为两组，一组用于分化第14天经4%PFA固定后拍照；另一组于分化第14天收集成骨细胞并提取mRNA，利用Takara反转试剂盒将其反转为cDNA，然后利用定量试剂盒对相关因子mRNA表达进行定量检测。查找Notch途径相关因子全基因序列后，利用Primer Express3.0设计引物并交由上海英俊生物技术公司合成。其引物序列如表4-10所示。
表4-10 Notch途径相关因子全基因引物序列表
（5）骨中相关基因mRNA表达检测：取已剔除肌肉等的骨组织，匀浆后按标准步骤提取RNA，将其反转为cDNA后对相关基因的定量表达进行检测。引物设计和合成同上。其引物序列如表4-11所示。
表4-11 骨中相关基因反转为cDNA后引物序列
Runx2、Osx、Col1和β-actin引物序列同上。
（6）骨中相关基因蛋白表达检测：取小鼠后肢胫骨，依据标准方法提取骨中总蛋白，并依照Western-blotting法标准步骤对骨中Runx2、Osx和Col1的蛋白表达进行检测（其Ⅰ抗均为兔源，购自CST，按1∶1 000稀释）。其PVDF膜利用Alpha凝胶成像系统进行显影拍照，并利用系统自带软件对相关数据进行分析。
5）数据处理
利用Excel和SPSS20.0进行数据分析，ZC与TC两组进行独立样本t检验，TC、TS和TD三组之间进行单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.研究结果
1）运动对T2DM小鼠体重的影响
由图4-15和表4-12可知，与ZC组相比，TC组小鼠体重显著升高（P＜0.01）。与TC组相比，TS组和TD组小鼠体重均显著升高（P＜0.01）。与TS组相比，TD组小鼠体重变化不显著（P＞0.05）。
图4-15 各组小鼠示意图
表4-12 运动对T2DM小鼠体重的影响（
）
注：与ZC组相比，**P＜0.01；与TC组相比，★★P＜0.01。
2）运动对T2DM小鼠BMD的影响
由图4-16和表4-13可知，与ZC组相比，TC组小鼠松质骨和皮质骨BMD均显著下降（P＜0.01）。与TC组相比，TS组小鼠松质骨和皮质骨BMD均升高但变化不显著（P＞0.05）；TD组小鼠松质骨BMD显著升高（P＜0.01），而皮质骨BMD变化不显著（P＞0.05）。与TS组相比，TD组小鼠松质骨和皮质骨BMD均升高但差异不具有显著性（P＞0.05）。
图4-16 各组小鼠BMD检测部位(https://www.daowen.com)
3）运动对T2DM小鼠骨组织形态结构的影响
由图4-17所示可知，与ZC组相比，TC组小鼠股骨近端松质骨微细结构显著退化。与TC组相比，TS组小鼠股骨近端松质骨微细结构变化不显著，而TD组却被显著改善。与TS组相比，TD组松质骨微细结构显著改善。
表4-13 运动对T2DM小鼠BMD的影响（
）
注：与ZC组相比，**P＜0.01；与TC组相比，★★P＜0.01。
图4-17 各组小鼠股骨Van Gieson染色示意图（×4）
4）运动对T2DM小鼠BMSCs分化产生成骨细胞中骨形成标志基因表达的影响
由图4-18（彩图见附录）所示和分析表4-14可知，与ZC组相比，TC组小鼠BMSC分化产生的成骨细胞显著增多且成骨细胞中Runx2、Osx、ALP和COl1的mRNA表达均显著下调（P＜0.01）。与TC组相比，TS组分化产生成骨细胞数量变化不显著且成骨细胞中ALP mRNA表达显著上调（P＜0.05），Runx2、Osx和COl1 mRNA表达均呈上调趋势但变化不显著（P＞0.05）；TD组分化产生成骨细胞显著增多且成骨细胞中Runx2、Osx、ALP和COl1 mRNA表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01）。与TS组相比，TD组分化产生成骨细胞数量显著增多且成骨细胞中Runx2、Osx、ALP和COl1的mRNA表达均显著上调（P＜0.05）。
图4-18 各组小鼠BMSC分化产生成骨细胞示意图（×4）
表4-14 成骨细胞中骨形成相关因子mRNA表达变化（
）
注：与ZC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TC组相比，★P＜0.05，★★P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05。
5）运动对T2DM小鼠骨中相关因子mRNA表达的影响
分析表4-15可知，与ZC组相比，TC组小鼠骨中Notch1、HES-1、Runx2、Osx和Col1的mRNA表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。与TC组相比，TS组Runx2、Osx和Col1的mRNA表达均显著上调（P＜0.05），Notch1和HES-1的mRNA表达上调均不显著（P＞0.05）；TD组Notch1、HES-1、Runx2、Osx和Col1的mRNA表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01）。与TS组相比，TD组Notch1、HES-1、Runx2和Osx的mRNA表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01），但Col1 mRNA表达上调不显著（P＞0.05）。
表4-15 骨中相关因子mRNA表达变化（
）
注：与ZC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TC组相比，★P＜0.05，★★P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。
6）运动对T2DM小鼠骨中相关因子蛋白表达的影响
由图4-19所示和表4-16可知，与ZC组相比，TC组Runx2、Osx和Col1蛋白表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。与TC组相比，TS组Runx2蛋白表达显著上调（P＜0.05），而Osx和Col1蛋白表达均呈上调趋势但不显著（P＞0.05）；TD组Runx2、Osx和Col1蛋白表达均显著上调（P＜0.05或P＜0.01）。与TS组相比，TD组Runx2和Osx蛋白表达均显著上调（P＜0.05），而Col1蛋白表达上调但不显著（P＞0.05）。
图4-19 骨中相关因子蛋白的表达
表4-16 骨中相关因子蛋白表达变化
注：与TC组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与TS组相比，△P＜0.05。
3.讨论分析
1）不同方式运动对T2DM小鼠骨表型的影响
骨代谢紊乱时，骨表型指标骨组织形态结构退化（首现于松质骨）和BMD下降，且骨组织形态结构与BMD呈密切正相关。T2DM的胰岛素抵抗和高血糖导致骨代谢失衡，骨组织微细结构退化和BMD下降，引发骨质疏松。利用micro-CT对T2DM小鼠胫骨检测发现，BMD、BV／TV、Tb.Th、Tb.N等骨组织形态计量学指标显著下降。本研究中，与ZC组相比，TC组小鼠松质骨和皮质骨BMD均下降，股骨远端Van Gieson染色显示松质骨微细结构显著退化，表明T2DM小鼠骨表型显著退化。分析原因，T2DM小鼠成骨细胞主导的骨形成被抑制和破骨细胞主导的骨吸收异常升高，导致骨质的大量流失，骨表型退化。运动在改善T2DM骨表型上扮演关键角色。研究发现，8周跑台运动显著改善T2DM小鼠股骨远端松质骨骨组织形态计量学指标、BMD和骨组织形态结构。本研究中，与TC组相比，TS组松质骨和皮质骨BMD及骨组织形态结构变化均不显著。但TD组松质骨BMD显著升高、骨组织形态结构显著改善，而皮质骨BMD变化不显著。这与Fu等研究证实T2DM小鼠骨代谢变化首现于松质骨相一致。提示，较之游泳，下坡跑可显著改善T2DM小鼠的骨组织形态结构和BMD。其机制与运动促进T2DM小鼠成骨细胞分化及骨形成能力密切相关。当成骨细胞主导的骨形成增强时，其分泌的Ⅰ型胶原蛋白等有机质增加，有助于钙、磷等矿物质在骨中沉积，进而改善骨组织形态结构、提高BMD。
2）不同方式运动对T2DM小鼠成骨细胞数量及骨形成基因表达的影响
T2DM的骨组织形态结构退化和BMD下降与其BMSCs分化产生的成骨细胞数量减少及其骨形成能力下降密切相关，该过程中Runx2、Osx、Col1、c-Fos、Fra2、OCN等关键蛋白或分子表达均显著下调。本研究发现，TC组分化产生的成骨细胞数量显著减少，且成骨细胞中Runx2、Osx和Col1的mRNA表达均显著下调。在众多影响因素中，运动可显著促进T2DM小鼠成骨细胞分化及其骨形成能力，但有关运动影响成骨细胞中调控其分化关键因子表达的相关研究尚鲜有报道。本研究中，8周运动结束后，TS组分化产生成骨细胞数量变化不显著且成骨细胞中仅Runx2 mRNA表达上调，但其下游靶基因Osx mRNA表达不显著；而TD组分化产生成骨细胞数量显著增多，且成骨细胞中Runx2、Osx和Col1 mRNA表达均上调。与TS组相比，TD组分化产生成骨细胞数量显著增多且成骨细胞中Runx2、Osx和Col1 mRNA表达显著上调。表明8周下坡跑可显著上调T2DM小鼠分化产生的成骨细胞中关键基因的表达，进而促进成骨细胞分化及其骨形成能力。这与下坡跑可激活T2DM小鼠骨中TGF-β／Smad途径和c AMP／CREB／Atf4途径有关，以上2条途径激活可显著上调成骨细胞分化关键因子Runx2、Osx、Col1等表达，促进成骨细胞分化。Notch是调控骨形成的关键途径，其调控下游Runx2、Osx、Col1等靶基因表达以影响成骨细胞分化及骨形成。但有关该途径介导运动促进T2DM小鼠成骨细胞分化或骨形成的相关研究尚待揭示。
3）不同方式运动对T2DM小鼠骨中Notch途径的影响
Notch是一条保守且关键的调控骨形成代谢信号通路。Notch1作为其关键亚型可被Delta（DLL1／3／4）和Jagged／Serrate（JAG1／2）配体所激活，导致蛋白质裂解并释放Notch细胞内区域（NICD）进入核内，在转录因子RBPJK调控下（包括大量靶基因表达）使其与多毛和Split-1增强剂（the hairy and enhancer of split-1，HES-1）作用。而HES-1是评价Notch途径是否激活的关键蛋白，其活化后可上调靶基因Runx2、ALP、Osx等表达，促进BMSC向成骨细胞分化；亦可刺激骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和Col1等骨形成标志基因表达，提高骨形成。T2DM抑制成骨细胞分化及骨形成，导致骨质疏松发生。这与T2DM骨中TGF-β／BMPs、c AMP／CREB／Atf4等途径被抑制有关。本研究中，T2DM小鼠骨中Notch1、HES-1、Runx2、Osx、Col1 mRNA表达及Runx2、Osx、Col1蛋白表达均下调。表明，T2DM小鼠骨中Notch途径被抑制。T2DM的能量代谢紊乱，导致调控因子Sirt1表达下调并抑制Notch1、HES-1及下游靶基因Runx2等表达。运动通过调控T2DM骨中信号通路（如TGF-β／BMPs、c AMP／CREB／Atf4等），从而促进成骨细胞分化及骨形成。本研究中，TS组Runx2、Osx、Col1 mRNA和Runx2蛋白表达均上调，但Notch的关键亚型Notch1、关键因子HES-1mRNA表达和该途径靶基因Osx、Col1蛋白表达均不显著；TD组Notch1、HES-1、Runx2、Osx、Col1 mRNA和Runx2、Osx、Col1蛋白表达均上调。与TS组相比，TD组Notch1、HES-1、Runx2、Osx mRNA和Runx2、Osx、Col1蛋白表达均上调，虽然靶基因Col1mRNA表达不显著，但其蛋白表达显著上调，这与Col1在翻译后发挥调控骨形成作用密切相关。表明下坡跑可显著激活T2DM小鼠骨中Notch途径，但游泳却不能。分析这两种运动对骨产生的力学刺激方式，下坡跑运动中骨受到强度较大的地面反作用力和肌肉牵拉力，而游泳运动仅肌肉受到牵拉力。较大强度的地面反作用力可上调T2DM小鼠骨中miRNA-25-3p、miRNA-21、金属蛋白酶17（metallopro-teinase 17，ADAM-17）及下游γ-分泌酶共激活因子FK506结合蛋白14（γ-secretase co-activa-tor FK506 binding protein 14，FKBP14）表达，从而与Notch1的RAM结构域锚蛋白重复序列结合，启动Notch1及下游途径。Delta Like-1（DLL1）为Notch途径上游的关键基因，胞内结构域与含有SNW结构的蛋白1（SNW domain-con-taining protein 1，SNW1）多聚化上调其表达，可激活特定共激活因子Mastermind Like-1（MAML-1），从而启动Notch途径。能量代谢紊乱是T2DM的发病主因，而下坡跑可改善T2DM的能量代谢和骨中相关长链非编码RNA（long-chainnon-coding RNA，LncRNA）表达，当调控能量代谢关键因子m TOR和LncRNA HOTAIR表达上调后，可激活Notch1及下游靶基因Runx2、Osx等表达。T2DM骨中IL-17等炎症因子表达上调，而运动可显著抑制IL-17表达，激活高尔基体内的furin蛋白酶并在Notch跨膜区胞外端s1位点对其进行酶切，作用于ECN（extracellu-lar Notch domain）结构域及NTM（Notch trans-membrane fragment）并与Ca2＋依赖的非共价键结合激活Notch途径。
4.结论
T2DM小鼠骨中Notch途径调控的成骨细胞分化及骨形成被抑制；下坡跑通过激活Notch途径改善T2DM小鼠的骨形成代谢紊乱，但游泳促骨形成的作用不显著。