三、酶法提取
酶法提取是在蛋白酶的作用下，胶原肽链发生定点水解，使胶原部分溶于水，实现胶原与铬分离。由于酶水解的选择性强、所需条件温和、对组成胶原蛋白的氨基酸的结构无破坏作用，水解产物的组成和相对分子质量分布较集中，可以制得不同等级的胶原蛋白产物，用途广泛。酶法提取是近10年来研究的热点。为了使水解产物与铬较好的分离，多采用中性蛋白酶或碱性蛋白酶，常将碱法水解与酶法水解结合使用。
酶法提取胶原蛋白包括两步法、碱酶法和酶预处理、碱法提胶。
1.两步法
美国农业部东部地区农业研究中心的M.M. Taylor，E.M.Brown和L.F.Cabega等，对用酶水解法提取铬革废弃物中的胶原蛋白进行了较为系统的研究工作。早期用碱性蛋白酶（5%～6%），于60～65℃的条件下水解铬革屑4～6h，分离得到铬含量很低的胶原水解物，用作饲料添加剂和肥料。在此基础上开发了较新的两步法工艺（two step process），第一步采用碱法水解，提取适用于化妆品、黏合剂、照相胶片和工业用明胶等胶原产物；第二步再用碱性蛋白酶提取在碱性条件下较难回收的胶原成分，并进行了工业性试验，其工艺流程及技术方案如图4-3所示。
2.碱酶法
L.F.Cabeza等在室温下，将铬革屑先用 0.01% 胃蛋白酶（pepsin）预处理8h，然后加入8%MgO，在70℃处理3h提取明胶。再用蛋白酶水解铬革渣（sludge），提取水解胶原（hydrolysate）。同时比较了用胰酶（trypsin）和碱性酶（protease）的提取效果。详细分析了提取产物的化学物理特性、相对分子质量分布，部分研究结果见表4-9～表4-12。
表4-9 用胰酶提取的胶原产物的化学物理特性
表4-10 用胰酶提取产物的相对分子质量分布
表4-11 用胃蛋白酶—碱性酶提取的胶原产物的特性
续表
表4-12 碱性蛋白酶提取产物的相对分子质量分布
从表4-9～表4-12可见，碱性蛋白酶的水解作用较胰酶的强，在0.01%的浓度下，水解胶原的提取率较后者高达18个百分点，在0.005%用量时高出20个百分点，水解胶原中的灰分含量、铬含量也较后者低，即用碱性酶的效果优于胰酶。胰酶的最佳用量为0.001%；碱性酶的最佳用量为0.01%。它们在此基础上进行了工业性实验，实验结果见表4-13。
表4-13 工业性实验结果
陈武勇等对用氧化镁和碱性蛋白酶（alcalase）两步法处理铬革屑进行了研究，首先用氧化镁提取明胶，再用碱性蛋白酶提取水解胶原。考查了提取pH、温度、时间和MgO及碱性蛋白酶用量对提取率和产物质量的影响。研究表明，最佳条件为：MgO 6%，pH9.5～10.0，温度60℃，反应时间1.5h。明胶收率达45%，水解胶原收率达35%左右，总蛋白质收率达80%左右。
陈武勇等研究了用1398中性蛋白酶提取水解胶原的各种影响因素，如酶的用量、反应温度和pH等对水解蛋白质收率的影响。综合各种影响参数，确定了制取水解蛋白质的最佳条件，用166蛋白酶和1398蛋白酶两步法处理铬革屑为最佳方案，采用此方案，水解胶原中Cr2O3的含量仅为10-6数量级，水解蛋白质的收率为45%左右，蛋白质总收率达到85%左右。
王坤余等对用MgO、CaO作碱化剂，用1398蛋白酶、2709蛋白酶、胰酶和碱性蛋白酶，通过两步法提取明胶和胶原多肽的效果进行了研究，先用MgO或CaO作碱化剂提取明胶，再在碱性条件下用上述蛋白酶提取水解胶原。明胶提取率可达45%，灰分含量为9%～10%。提胶后的铬革渣用不同蛋白酶水解提取胶原多肽的效果见表4-14。
表4-14 不同蛋白酶的提取效果
王坤余和张铭让，以铬革屑或铬革块为原料，皮水比1.5～6，用CaO或Ca（OH）2、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、KOH等调节pH至10～11，在80～90℃，处理2～5h，过滤，滤液通入CO2或加入Na2CO3、NaHCO3或Na2HPO4、NaH2PO4，静置5～15h，经过滤除去沉淀物，清液通过强酸性阳离子交换树脂处理，可制得高纯度的胶原蛋白，以绝干固体物计，灰分≤0.5%，其中Ca2+和Mg2+含量＜0.2%，Cr3+≤0.2mg/kg，氨基酸总量达95%。若将上述胶原采用蛋白酶定向水解，可制得高纯度的不同相对分子质量的胶原多肽。
3.酶预处理、碱法提胶
M.M.Taylor等研究了提取明胶时，分别用胃酶和胰酶处理后的情况，根据所提取明胶的化学组成（灰分、铬含量、固含量等）、胶的强度、动态黏度和相对分子质量分布的研究结果认为，胃酶的用量以0.1%～0.25%为宜，胰酶的水解作用较胃酶的强，其用量以0.01%～0.25%为宜，部分结果见表4-15和表4-16。酶预处理后碱法提胶流程如图 4-4所示。
图4-4 酶预处理后碱法提胶流程图
表4-15 酶及其用量对用铬革屑提取明胶的影响
表4-16 酶用量与所提明胶的强度及相对分子质量分布的关系
