三、实验内容
（一）仪器与材料
1.仪器
主要有恒流泵、紫外-可见分光光度计、分析天平、恒温水浴、红外灯、玻璃插管、移液管、锥形瓶（100 mL）、注射器（20 mL）、剪刀、镊子、手术刀片等。
2.材料
主要有法莫替丁、酚红、1 mol/L NaOH、生理盐水、Krebs-Ringer缓冲液、20%乌拉坦溶液等。
动物：实验大鼠，体重（200±20）g，实验前禁食一夜，可自由饮水。
（二）实验部分
1.供试液的配制
（1）法莫替丁供试液（100 μg/mL）：精密称取法莫替丁25 mg和酚红5 mg，加Krebs-Ringer缓冲液使溶解（必要时微热），并稀释到250 mL，即得。
（2）酚红溶液（20 μg/mL）：精密称取酚红5 mg，加Krebs-Ringer缓冲液使溶解，并稀释到250 mL，即得。
2.大鼠在体肠管回流操作
（1）大鼠麻醉：用20%（g/mL）乌拉坦溶液按1 g/kg给大鼠腹腔注射麻醉，翻正反射消失后，将背部固定于操作台上。
（2）小肠两端插管：腹部除毛后，沿腹部正中线切开腹部（3～4 cm），在小肠段间隔10 cm处各插入细玻璃管1支，并用手术线扎紧插入端，另一端分别接橡皮管（小肠上端向下插，小肠下端向上插）。
（3）洗涤肠管：将37℃生理盐水经小肠上端玻璃管缓慢注入肠管，洗去肠管内容物，充分洗涤后送入空气使洗涤液尽量流尽。
（4）肠管回流：按图19-2进行肠管回流实验。吸取法莫替丁供试液50 mL置贮液瓶中（贮液瓶置于37℃水浴中保温），开动恒流泵进行循环流动，药液从小肠上端流入肠管，经小肠下端流入贮液瓶中，先以5 mL/min的流速回流10 min，然后将流速调节为2.5 mL/min，再循环流动120 min。
图19-2 大鼠在体肠管回流装置
（5）取样：回流开始后10 min，从贮液瓶取供试液两份，一份1 mL，另一份0.5 mL，分别作为药物和酚红的零时间样品。其后，每隔10 min同样取样两份，每次取样后，立即补充1.5 mL 20 μg/mL酚红溶液。取样至120 min后停止回流。测定供试液中法莫替丁和酚红的浓度。
3.含量测定
（1）法莫替丁的测定:
①法莫替丁标准曲线：精密称取法莫替丁12.5 mg，置于100 mL容量瓶中，用Krebs-Ringer缓冲液溶液并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液用。精密量取法莫替丁贮备液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL至25 mL容量瓶中，各加5 mL浓度为20 μg/mL的酚红溶液，用Krebs-Ringer缓冲液稀释至刻度，得法莫替丁浓度为2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10.0 μg/mL、12.5 μg/mL、15.0 μg/mL的标准溶液。以Krebs-Ringer缓冲液为空白，分别在284 nm及265 nm处测定A1与A2值，计算ΔA=A1-A2（双波长等吸收消去法），以ΔA与法莫替丁浓度C（μg/mL）进行线性回归，得法莫替丁标准曲线。
②供试液中法莫替丁的测定：将供试液1 mL置于25 mL容量瓶中，用Krebs-Ringer缓冲液稀释至刻度，摇匀。以Krebs-Ringer缓冲液为空白，分别在284 nm及265 nm处测定A1与A2值，计算ΔA=A1-A2。根据标准曲线计算法莫替丁的浓度。
（2）酚红的测定：
①酚红标准曲线：取酚红25 mg，用Krebs-Ringer溶液加热溶解至250 mL容量瓶中，并稀释至刻度。取5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL加至50 mL容量瓶中，用Krebs-Ringer稀释至刻度。各取0.5 mL酚红溶液加至5 mL 1 mol/L NaOH中，摇匀，于557 nm测吸光度。以1 mol/L NaOH液为空白，以吸收度A与酚红浓度C（μg/mL）进行线性回归，得酚红标准曲线。
②供试液中酚红的测定：将供试液0.5 mL与5 mL 1 mol/L NaOH摇匀，用1 mol/L NaOH作为空白对照液，在557 nm处测定吸收度。按标准曲线计算酚红的浓度。
【注解】
（1）适应证及用法：适用于胃及十二指肠溃疡、反流性食管炎、上消化道出血等症。
（2）Krebs-Ringer磷酸缓冲液的配方：1000 mL蒸馏水中含氯化钠7.8 g、氯化钾0.35 g、氯化钙0.37 g、碳酸氢钠1.37 g、磷酸二氢钠0.22 g、氯化镁0.22 g、葡萄糖1.4 g，用盐酸调节pH至7.4。
（3）20%乌拉坦溶液用于大鼠麻醉时使用剂量为每千克体重腹腔注射1 g。
（4）小肠插管时，将小肠上端剪一小缺口，插入直径为7 mm的玻璃管，小肠下端则插入直径为5 mm玻璃管。插管后，将小肠小心放回腹腔，注意维持完整的小肠血液供应。在鼠腹部切口部位覆盖生理盐水纱布，并用红外灯维持体温在37℃。
（5）洗肠管时，用150～200 mL（37℃生理盐水）沿小肠上端插管缓慢注入肠管，冲洗去肠内脏物，冲洗速度要缓慢，以免把小肠胀破。
（6）由于小肠存在黏膜皱袋、绒毛及微绒毛等结构，因此很难测定吸收性黏膜的真实表面积。本实验中实验小肠段的浆膜面积计算方法为：将回流小肠段冲洗后剖开，平铺于坐标纸上，沿小肠边缘剪下坐标纸，冲洗后晾干，精密称重。剪取10倍面积的坐标纸称重，即为小肠浆膜面积。