三、实验内容
（一）材料与仪器
1.仪器
主要有分析天平、可见分光光度计、恒温水浴锅等。
2.材料
主要有维生素B2片（每片含核黄素5 mg）及核黄素对照品、保险粉（连二亚硫酸钠）、冰醋酸等。
（二）实验部分
1.核黄素标准曲线的制备
标准溶液配制：精密称取105℃干燥1 h的核黄素对照品50 mg，转移至500 mL容量瓶中，加0.02 mol/L醋酸溶液300 mL，置水浴中加热溶解，放冷至室温，以0.02 mol/L醋酸溶液定容，摇匀得浓度为100 μg/mL的核黄素对照品储备液，置凉暗处保存。
精密吸取核黄素对照品储备液0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL和3 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用酸化蒸馏水（1%冰醋酸水溶液，mL/mL）稀释至刻度，摇匀得对照液。以酸化蒸馏水为空白，在444 nm波长处测定吸光度（A1），然后加入保险粉（连二亚硫酸钠）约3 mg，摇匀，在1 min内再次测定吸光度（A2），两次测定吸光度的差值（ΔA=A1-A2）即为核黄素的吸光度，记入表21-1中，以ΔA为纵坐标，对照液浓度（C，μg/mL）为横坐标，拟合得标准曲线。
2.尿液样品的收集
受试者服药前一天需要收集24 h空白尿液，量取尿液体积并记录于表21-2中，再将部分尿液（约10 mL）贮存在盛有少量（约0.2 mL）冰醋酸的试管内，摇匀，供测定空白尿中核黄素含量使用。临服药前排空小便，早餐后立即口服核黄素三片（5 mg/片），以温水送服，并记录服药时间。于服药后2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h收集尿液，并由量筒量取尿液体积后记录于表21-3中，再将部分尿液（约10 mL）贮存在盛有少量（约0.2 mL）冰醋酸的试管内，摇匀，于阴凉避光处保存，待测。
表21-3 尿样收集记录
3.尿药浓度的测定
（1）空白尿液中核黄素浓度的测定
取酸化空白尿液适量，按“核黄素标准曲线的制备”方法，自“以酸化蒸馏水为空白……”起操作，测定吸光度，将两次测定值之差（ΔA）代入标准曲线，求出空白尿中核黄素浓度，记入表21-2中。
（2）含药尿样中核黄素浓度的测定
分别取不同时间收集的含药尿液样品适量，按“核黄素标准曲线的制备”方法，自“以酸化蒸馏水为空白……”起操作，测定吸光度，将两次测定值之差（ΔA）代入标准曲线，求出含药尿样中核黄素浓度，记入表21-4中。
表21-4 尿药测定记录
【注解】
（1）服药前2天及实验期间应控制食谱，不得吃富含维生素B2的食物，如鸡蛋、牛奶、奶糖等，并不得服用含B族维生素的药品。
（2）受试者每次收集尿液后，喝200 mL左右的饮用水，以维持一定体积的尿量。（3）在制备标准曲线时，也可用酸化的空白尿液作为溶媒，替代0.02 mol/L醋酸溶液。
（4）尿药浓度测定过程中，均应注意避光操作。