间接免疫荧光法

一、间接免疫荧光法

人喉鳞状细胞癌细胞系人上皮2型（human epithelial type 2，HEp—2）细胞含有数百种抗原的天然蛋白阵列，可作为检测抗核抗体的理想底物（图1—2—1）。以HEp—2细胞为基质的间接免疫荧光法（HEp—2 cell indirect immunofluorescent assay，HEp—2 IFA）被认为是ANA筛查的参考方法［3］，可检测多种自身抗体并呈现相应的荧光核型（表1—2—1）。HEp—2 IFA检测结果通常包括：①样本中是否存在抗核抗体，由于一般人群中也可存在低滴度的自身抗体，但系统性自身免疫病（systemic autoimmune rheumatic disease，SARD）患者体内的自身抗体一般为中滴度、高滴度；②荧光核型通常表明特定样本中最可能存在的自身抗体特异性，有助于区分非自身免疫病个体与自身免疫病（autoimmune diseases，AID）患者，同时结合临床症状，有助于指导下一步特异性血清学分析。

（一）检测原理

1.HEp—2 IFA实验原理·HEp—2 IFA检测ANA通常采用磷酸缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）对样本进行稀释。目前有两种稀释体系，即倍比稀释和稀释系统（图1—2—2）。稀释后的样本与固定在玻片上的HEp—2细胞抗原基质共同温育（图1—2—3 A），若样本中存在抗核抗体，可与抗原结合形成抗原抗体复合物（图1—2—3B）。清洗去除未反应的抗体后，再用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗人γ重链和κ、λ轻链抗体（荧光标记二抗）与基质上的抗原抗体复合物进行反应，形成抗原抗体—荧光标记二抗复合物（图1—2—3C）。清洗去除未反应的荧光标记二抗后，在特定波长的荧光显微镜下观察荧光反应。

2.荧光显微镜成像原理·以目前实验室常用的落射式荧光显微镜为例（图1—2—4），在需要观察FITC荧光素时，由于FITC最大吸收波长为490～495nm，最大发射波长为525～530nm，光源先经过激发滤片（图1—2—4①），波长为450～490nm的蓝光通过后，被呈45°角的分光滤片（可反射波长低于510nm的光）反射至载物台上的样品表面，样本表面的FITC吸收蓝光后，发射出波长525～530nm的光返回到分光滤片（图1—2—4②，可透过波长高于510nm的光），直接透射过去。到达发射滤片（图1—2—4③）后，发射滤片消减不必要的荧光信号，将波长520～560nm的特异性绿色荧光传递至目镜，人眼就可以通过目镜观察到成像。

（二）结果报告

HEp—2 IFA结果判读通常需要使用荧光显微镜，一般以低倍镜判读阴阳性，高倍镜观察荧光核型。临床实验室报告HEp—2 IFA法结果应至少包括：①检测方法学、起始滴度和使用的滴度体系（倍比稀释或稀释体系）；②定性结果（阳性/阴性）；③荧光核型，主要核型和次要核型；④滴度，分别报告主/次要核型滴度或至少报告主要核型滴度；⑤复查结果，若实验室对检测报告中可疑的实验结果进行复查，应在报告中体现并说明；⑥必要的临床建议。在临床实践工作中，我们还建议报告以下内容。

1.核型滴度估计值·部分临床实验室HEp—2 IFA不做样本梯度稀释，而是根据判读人员经验或同一批实验中已知滴度的阳性质控为依据，在显微镜下人工估计ANA滴度。这种情况下不建议实验室在报告中给出滴度的具体值，如1∶80、1∶160等，而可给出数字化荧光强度等级提示（如“1+”～“4+”，或“+”～“++++”）。通常，“1+”表示最低强度特异性荧光（lowest specific fluorescence），“2+”表示清晰可见的阳性荧光（clearly distinguishable positive fluorescence），“3+”表示明亮的苹果绿荧光（bright apple-green fluorescence），“4+”表示强烈的苹果绿荧光（brilliant apple-green fluorescence）［5］。

2.复合核型报告·对存在两种或两种以上复合核型结果，核型报告顺序建议按照细胞核、细胞胞浆和有丝分裂期荧光模型顺序进行报告。若复合核型属于同一类荧光模型，例如，都属于细胞核荧光模型，则建议按滴度高低顺序依次报告。