细颗粒型（AC—4）

二、细颗粒型（AC—4）

【荧光核型特征】

1.分裂间期细胞·核浆呈现较均匀细颗粒样染色，核仁可染色或阴性（图3—3—3）。

2.有丝分裂期细胞·浓缩染色体阴性（图3—3—3）。

【核型鉴别】

1.粗颗粒型（AC—5）·间期细胞内颗粒AC—4细小且染色均匀，AC—5颗粒较粗大。某些品牌HEp—2 IFA荧光片AC—4与AC—5较难区别，可报告核颗粒型（AC—4/AC—5）。

2.均质型（AC—1）+细颗粒型（AC—4）混合核型·与AC—4单一核型相同，AC—1和AC—4混合核型间期细胞核呈细颗粒样染色。但后者分裂中期、分裂后期及分裂末期细胞染色体阳性且染色均匀，而AC—4单一核型分裂期细胞染色体阴性。

3.点状核膜型（AC—12）·与AC—4相同，AC—12间期细胞核呈细颗粒样染色，且分裂期细胞染色体阴性。但AC—12间期细胞核膜呈现颗粒状或点状荧光，相邻细胞接触部分荧光染色增强，而AC—4无该荧光特征。

【相关靶抗原】

（一）SSA/Ro60

1.生物学功能·SSA/Ro60是胞质小核糖核蛋白复合体（small cytoplasmic ribonucleoprotein complexes）的一种蛋白质组分，位于细胞核及核仁中。它能结合错误折叠的非编码RNA，可能参与其最终降解，此外在紫外线照射后的细胞存活中也有重要作用。SSA/Ro60由两个结构域组成，一个是由一系列α螺旋重复序列组成的环状结构，另一个结构域类似于血管性血友病因子A（von Willebrand factor A）。SSA/Ro60通常与一些功能未知的非编码RNA（称为Y RNAs）组成Ro60—Y RNAs复合物。在脊椎动物细胞中，因核磷蛋白SSB/La常结合许多新转录的非编码RNA包括Y RNAs，故SSB/La存在于Ro60—Y RNAs复合物中。

此外，抗SSA/Ro60抗体阳性患者常伴有抗Ro52抗体阳性，但目前尚无法证明Ro52可与Ro60—Y RNAs复合物结合。Ro52实为三结构域蛋白（tripartite motif，TRIM）家族的TRIM21，是一种泛素E3连接酶（ubiquitin E3 ligase），而并非Ro蛋白，因此两者同时检出的原因尚需进一步研究。

2.临床意义

（1）干燥综合征（Sjogren’s syndrome，SS）：38％～90％的SS患者可检出抗SSA/Ro60抗体，因此该抗体被美国风湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）和欧洲抗风湿病防治联盟（European League Against Rheumatism，EULAR）定为SS诊断标准（2016 ACR—EULAR分类标准）之一［4］。SS可分为两种亚型，一种仅累及唾液腺和泪腺，导致眼干和口干；另一种累及其他器官，导致血管炎、间质性肺病（interstitial lung disease，ILD）、周围神经病变、中枢神经系统疾病、间质性肾炎、淋巴瘤等疾病。抗SSA/Ro60抗体阳性SS患者多为后者，易发生上述腺外表现及合并症、高丙种球蛋白血症及其他B细胞活化表现。因此相较于该抗体阴性患者，抗SSA/Ro60抗体阳性SS患者预后较差。

（2）系统性红斑狼疮：抗SSA/Ro60抗体可检出于30％～40％的SLE患者。该抗体阳性的成人及儿童SLE患者，以皮肤和骨骼肌肉受累为主，可见皮疹、光敏感、皮肤血管炎，但肾脏、神经系统受累较少，且较少发生血小板减少症［5］。

（3）新生儿并发症：母体中抗SSA/Ro60抗体和（或）抗SSB/La抗体通过胎盘后，可引起胎儿短暂并发症，如约10％的婴儿出现新生儿红斑狼疮皮疹，20％出现短暂性血细胞减少，30％出现轻度短暂性转氨酶升高，但这些并发症可随着孩子体内母体抗体的减弱而自然消失。抗SSA/Ro60抗体和（或）抗SSB/La抗体阳性，且无新生儿狼疮生育史的孕妇所产胎儿中，约2％可发生完全性心脏传导阻滞（complete heart block，CHB）；而有新生儿狼疮生育史的孕妇所产胎儿中，约13％～18％可发生CHB。这可能是母体自身抗SSA/Ro60抗体和抗SSB/La抗体通过胎盘引起胎儿房室结炎症和随后的纤维化所致。

（4）抗SSA/Ro60抗体与抗Ro52抗体：抗Ro60抗体与抗Ro52抗体双阳性，常见于原发性干燥综合征；抗Ro60抗体阳性，抗Ro52抗体阴性，多见于SLE患者；仅抗Ro52抗体阳性，可见于SSc、肌炎、其他炎症性风湿免疫病或非自身免疫病患者。

3.检测方法·HEp—2不是IFA筛查抗SSA/Ro60抗体的理想细胞底物，主要原因为HEp—2细胞内SSA/Ro60抗原丰度较低，以及乙醇、甲醛等细胞固定剂会明显降低其荧光强度，因此部分抗SSA/Ro60抗体阳性血清呈现HEp—2 IFA阴性（AC—0）。HEp—2000细胞是经Ro60 cDNA转染的HEp—2细胞，可明显提高IFA检测抗SSA/Ro60抗体的敏感性（敏感性77％～91％）［6］。转染HEp—2000细胞中有10％～15％的细胞在与抗SSA/Ro60抗体阳性血清孵育后表现出明显的细颗粒及核仁染色。临床实验室常采用ELISA、LIA、CLIA和流式荧光法检测抗SSA/Ro60抗体（表3—3—2）。值得注意的是，部分抗SSA抗体检测试剂盒包被的纯化SSA抗原，实际为SSA/Ro60与Ro52的混合物。因抗SSA/Ro60抗体与抗Ro52抗体临床意义不同，建议临床实验室分开检测该两种抗体。科研实验室除上述方法外，还可采用ALBIA、固相多分析物阵列（solid-phase multianalyte arrays）检测，但WB无法检测抗SSA/Ro60抗体，其原因为在蛋白变性过程中，Ro60的抗原性丧失［7］。

（二）SSB/La

1.生物学功能·SSB/La蛋白（分子量48 kDa）是一多区域磷酸化蛋白，包括高度保守的N端La型核糖核酸结合域（La-type ribonucleic acid-binding motif，LAM）、中间典型RNA识别域（RNA recognition motif 1，RRM1）、C端非典型RNA识别域2（RNA recognition motif 2，RRM2），以及一条长多肽链［包含短基本结构域（short basic motif，SBM）］。SSB/La蛋白可结合多种RNA分子，包括Ro60—Y RNAs复合物，其中LAM，以及RRM1主要识别并结合RNA聚合酶Ⅲ（RNA polymeraseⅢ，RNAPⅢ）转录RNA产物的特异性多尿苷酸序列（U），RRM2和SBM则与非多尿苷酸序列RNA ［non-poly（U）RNA］ ，如病毒RNA、末端寡嘧啶信使RNA（messenger RNA，mRNA）相结合。SSB/La蛋白在RNA代谢中发挥不同作用，可作为RNAPⅢ转录的终止因子，并在细胞周期中转录物的成熟过程起关键作用。同时该蛋白也是一种E3连接酶，可调节γ干扰素诱导的细胞因子的产生。

2.临床意义·抗SSB/La抗体可在30％～50％的SS患者中检出，但一般同时伴有抗SSA/Ro60抗体阳性。仅2.3％～7％的SS患者存在抗SSB/La抗体单阳性（抗SSA/Ro60抗体阴性）［8］。在抗SSA/Ro60抗体单阳性或抗SSA/Ro60抗体与抗SSB/La抗体双阳性患者中，表现为SS的典型临床表现，如干眼、口腔干燥等，明显重于抗SSB/La抗体单阳性或者抗SSA/Ro60抗体和抗SSB/La抗体均阴性患者。因此2016年ACR/EULAR将抗SSB/La抗体从SS诊断标准（2016 ACR—EULAR）中去除［4］。

3.检测方法·临床实验室一般采用ELISA和LIA检测抗SSB/La抗体（表3—3—3），两种方法敏感性特异性相似。值得注意的是，ELISA包被人来源抗原检测抗SSB/La抗体敏感性远高于牛来源抗原 ［敏感性：93％（人来源）vs.50％（牛来源）］ ［9］。科研实验室可采用RNA沉淀法（RNA precipitation）、ALBIA、对流免疫电泳（counter immune electrophoresis）进行检测，其中RNA沉淀法是检测抗SSB/La抗体的金标准。由于SSB/La与Ro52电泳迁移率相似且常同时检出，不推荐WB检测抗SSB/La抗体。

（三）Mi—2

1.生物学功能·Mi—2作为核小体重构脱乙酰酶复合物（nucleosome remodeling-deacetylase）的重要组成部分，是一种脱氧核糖核酸依赖性核小体刺激的腺苷三磷酸酶，参与调节基因转录。抗Mi—2抗体是第一个以小牛胸腺提取液为抗原，经免疫双扩散识别的皮肌炎（dermatomyositis，DM）自身特异性抗体，可免疫沉淀两种蛋白质：Mi—2α（530 AA，220 kDa）和Mi—2β（1 912 AA，218 kDa）。Mi—2α与Mi—2β的N端区域（137～645 AA）的序列有83.3％相似性。

2.临床意义·抗Mi—2抗体属于肌炎特异性抗体（myositis-specific antibody，MSA）之一，对DM有较高特异性，其在成人DM中检出率为11％～59％，在儿童DM中检出率为4％～10％［10］，而在多发性肌炎（polymyositis，PM），以及散发性包涵体肌炎（sporadic inclusion body myositis）中少见。因缺乏大规模的多中心研究，抗Mi—2抗体目前尚未被纳入特发性炎性肌病（idiopathic inflammatory myopathies，IIM）诊断标准中。抗Mi—2抗体阳性DM患者常有向阳性红斑、披肩样皮疹、角质层过度生长、Gottron丘疹和V字征等典型DM皮肤损伤，但一般对皮质类固醇类激素疗效较好，肺部受累发生率低，且并发其他恶性肿瘤的比率明显低于抗小泛素样修饰激活酶（small ubiquitin-like modifier activating enzyme，SAE）、抗转录中介因子1γ（transcriptional intermediary factor 1γ，TIF1γ），以及抗核基质蛋白2（nuclear matrix protein—2，NXP—2）等MSA。另外，抗Mi—2抗体滴度可能与疾病活动度有关，但尚需进一步临床研究证实。

3.检测方法·抗Mi—2抗体虽然在HEp—2 IFA表现为核细颗粒荧光核型，但该方法学并不适合进行抗Mi—2抗体筛查。免疫沉淀法（immunoprecipitation，IP）为检测抗Mi—2抗体的金标准，仅科研开展，无商品化试剂盒。临床实验室常用的检测方法包括LIA和ELISA（表3—3—4）。研究显示LIA检测结果为抗Mi—2α抗体和抗Mi—2β抗体双阳性的血清，IP一般抗Mi—2抗体阳性（真阳性），LIA仅抗Mi—2β抗体单阳性者常为假阳性，而抗Mi—2α抗体单阳性者约50％为真阳性。［11］另外，LIA抗Mi—2抗体信号强度（灰度值）与ELISA检测结果相关性高，可用于准确估计抗Mi—2抗体滴度［11］。科研实验室可采用IP和基于粒子的多分析物技术（particle-based multi-analyte technology，PMAT）［10］等方法检测。PMAT与LIA对于抗Mi—2抗体检测相关性好，且PMAT抗Mi—2β抗体阳性检测结果与DM临床症状相关性高［10］。

（四）Ku

1.生物学功能·Ku蛋白是由Ku70（p70，70 kDa）和Ku80（p80，80 kDa）组成的位于细胞核内的异源二聚体，可结合dsDNA，通过非同源末端连接（non-homologous end-joining）途径，在dsDNA修复过程起关键作用。另外，Ku蛋白在V（D）J重组和端粒保护等过程中也起着重要作用，参与DNA复制和基因转录调控。

2.临床意义·抗Ku抗体最初报道见于硬皮病—多发性肌炎重叠综合征（sclerodermapolymyositis overlap syndrome，SSc—PM重叠征）患者，但随后发现其可检出于多种自身免疫病，包括MCTD、SLE、SS、SSc、IIM、SSc—IIM重叠征、RA等。

（1）肌炎相关抗体：在肌炎抗体谱中，抗Ku抗体不是MSA，而属于肌炎相关抗体（myositisassociated autoantibody，MAA）。抗Ku抗体在中国IIM患者中检出率约1.7％，常伴有ILD，以及肌酸激酶升高。皮疹常见于抗Ku抗体合并MSA阳性患者，而抗Ku抗体单阳性IIM患者则更易发生严重的免疫介导坏死性肌病（immune-mediated necrotizing myopathy）和ILD。

（2）系统性红斑狼疮：抗Ku抗体可检出于SLE患者，且不同人种SLE患者中检出率差异较大，如亚洲人4.1％～6％［12］、非洲裔美国人14％、美国白种人0.6％［13］。抗Ku抗体阳性IIM患者常合并SLE。此外，若抗Ku抗体阳性患者合并抗dsDNA抗体阳性，易并发肾小球肾炎。

3.检测方法·IP是检测抗Ku抗体的金标准。临床实验室一般采用LIA检测抗Ku抗体（表3—3—5）。值得注意的是，Ku蛋白是DNA结合蛋白，当固相包被的Ku蛋白中存在DNA污染，而患者血清中有抗dsDNA抗体时，可出现抗Ku抗体假阳性。另外，若患者血清中存在抗dsDNA抗体/DNA复合物，该复合物中的DNA可能会与固相包被的Ku蛋白结合，造成抗Ku抗体假阳性。因此，检测抗Ku抗体时需注意DNA干扰（0.5 mol/L或更高浓度的氯化钠溶液可洗脱DNA与Ku蛋白的结合）。科研实验室可采用IP、ELISA等检测抗Ku抗体，或通过WB区分抗Ku70抗体及抗Ku80抗体两种抗体。

（五）TIF1γ

1.生物学功能·TIF1γ属于TRIM超家族，又被称为TRIM33，分子量约155 kDa。其N末端有一个RBCC（ring-B-boxcoiled-coil）单元，包括一个环结构域（ring domain）、B盒（B boxes）和一个螺旋线圈结构域（coiled-coil domain），所有这些都与Smad4泛素化有关，而Smad4则在TGFβ信号传导通路中起重要作用；C末端的PHD（plant homeodomain）和bromo结构域可与H3、H4相互作用；中间连接体能与活化的Smad2和Smad3相互作用。TIF1γ在转录延伸、DNA修复、细胞分化、胚胎发育、有丝分裂和皮肌炎中均有作用。另外，TIF1γ在不同的细胞中既可以作为肿瘤抑制因子也可作为启动子发挥作用：在非小细胞肺癌、乳腺癌、胶质瘤和肾透明细胞癌中，TIF1γ作为肿瘤抑制因子，其表达降低；而在B淋巴细胞白血病、胰腺癌和宫颈癌中，TIF1γ起到了肿瘤启动因子的作用，可阻止肿瘤细胞凋亡。

2.临床意义·抗TIF1γ抗体为肌炎特异性抗体之一，可见于7％～31％成人DM，以及23％ ～35％幼年型皮肌炎（juvenile dermatomyositis，JDM）患者［14］。在成人DM患者中，抗TIF1γ抗体是肿瘤相关皮肌炎（cancer-associated dermatomyositis）的血清标志物，其增加DM患者并发恶性肿瘤的风险一般仅见于DM发病三年内。这种情况多见于39岁以上患者，并发的肿瘤以乳腺癌、卵巢癌和肠癌多见［15］。抗TIF1γ抗体阳性DM患者一般较少发生ILD、雷诺现象及关节炎/关节痛等症状，但常发生更广泛的皮肤受累，其特征性皮肤表现包括：手掌角化过度、丘疹、银屑病样病变、色素减退和“白上红”毛细血管扩张斑块；此外，尽管患者吞咽困难风险更高，但肌炎症状较轻。

3.检测方法·临床实验室常采用LIA检测抗TIF1γ抗体（表3—3—6），科研实验室可采用放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation）［15］和ELISA进行检测。研究表明LIA（κ=0.88）和ELISA（κ=0.91）检测抗TIF1γ抗体与IP的结果有较高一致性，LIA与ELSIA两者间结果一致性也较高（κ=0.91）［16］。