线性免疫印迹法
线性免疫印迹法（line immunoassay，LIA）是目前实验室常用的检测ANA谱方法，可实现同时检测样本中的多种自身抗体。
（一）靶抗原及质控带的包被原理
1.靶抗原的包被·商品化LIA试剂盒内的单人份膜条，通常依据靶抗原的特性，将不同的靶抗原包被在合适材质的载体膜上，以保证膜条检测的敏感性和特异性，完成患者样本内多种不同自身抗体的检测。通常情况下，包被的抗原可分为天然抗原和重组抗原。
（1）天然抗原：采用物理和化学方法裂解动物组织，从裂解液中提取并经亲和层析纯化制备相应的天然抗原。此种方法获得的抗原容易保持蛋白（抗原）构象和天然修饰（磷酸化、甲基化、糖基化等）。
（2）重组抗原：采用基因工程技术反转录获得相应的cDNA，用杆状病毒系统在昆虫或动物细胞中表达，克隆出特定蛋白（抗原）。
采用喷涂技术将抗原包被在适宜的载体膜上，然后将不同的模块组合在不同的膜条上，形成不同种类的检测膜条（图1—2—5）。
2.质控带的包被·每个检测膜条均包含一个质控带检测模块，用以监控该膜条的整个实验过程是否正常。目前LIA商品化试剂盒质控带主要有2种（图1—2—5），其包被的质控物以及质控物的判读标准有所不同。
（1）质控带包被物：①包被多克隆抗人IgG抗体（如欧蒙印迹法），在加入血清样本后，质控带中的多克隆抗人IgG抗体与血清中的IgG结合，所形成的复合物再与酶标记二抗结合，在底物液温育后出现颜色反应。若漏加样本、酶标记二抗或底物中任何一种，则无颜色反应。②包被人血清IgG（如亚辉龙印迹法），在加入酶标记二抗后，质控带中的人血清IgG与酶标记二抗结合，在底物液温育后出现颜色反应。若漏加酶标记二抗或底物，则无颜色反应。
（2）质控带判读标准：①单质控带，如图1—2—5膜条A。若实验过程正常，质控带的着色等级应为3+，说明该膜条的靶抗原结果均可信；其他结果如无质控带、质控带着色等级为1+或2+等均说明实验结果异常，膜条的靶抗原结果均不可信，应重复实验或检测样本IgG的含量是否正常。②多质控带，如图1—2—5膜条B。若实验正常，强阳性质控带的着色等级应为3+，中阳性质控带的着色等级应为2+，弱阳性质控带的着色等级应为1+，说明膜条的靶抗原结果均可信；其他结果如无质控带、三条质控带着色等级不满足强阳性＞中阳性＞弱阳性等都表示实验结果异常，此时膜条靶抗原结果均不可信，应重复实验。
图1—2—5 ANA谱检测膜条
膜条A：单质控带膜条［来源于欧蒙医学诊断（中国）有限公司］；膜条B：多质控带膜条
（二）检测原理
检测时，样本中特定抗体与相应靶抗原结合形成抗原抗体复合物，再加入碱性磷酸酶标记的抗人IgG（或IgM）抗体，结合后形成抗原抗体—酶标记二抗免疫复合物，最后加入底物液（5—溴—4—氯—3—吲哚基磷酸盐/四唑硝基蓝），产生灰色颜色反应（图1—2—6A）。因样本中不同抗体含量不同，与载体膜上相应靶抗原结合程度不同，可得到颜色深浅不一的条带，通过专业软件分析，可得到不同数值的着色强度，对应不同的着色等级［0，（±），1+，2+，3+］，实现对结果的半定量判读。
图1—2—6 免疫印迹法检测抗核抗体反应原理图及全自动免疫印迹仪
A.免疫印迹法检测抗核抗体反应原理；B.ELMP全自动免疫印迹仪［来源于欧蒙医学诊断（中国）有限公司］
目前，免疫印迹法已实现整个实验过程的自动化，如欧蒙全自动免疫印迹仪（EURO Line Master Plus，ELMP）可完成从加样、检测、判读到数据上传全自动化，减少人为操作和结果判读误差（图1—2—6B）。