·均质型（AC—1）

第二节·均质型（AC—1）

【荧光核型特征】

1.分裂间期细胞·细胞核呈均匀荧光染色，核仁有时呈阴性（图3—2—1）。

2.有丝分裂期细胞·分裂中期、后期和末期浓缩染色体呈均匀、透明的增强荧光，染色体周围区域荧光染色呈阴性（图3—2—1）。

【核型鉴别】

1.致密细颗粒型（AC—2）·AC—1间期细胞染色均匀，而AC—2间期细胞核呈明暗相间的颗粒样染色，且分裂中期细胞染色体有明显颗粒感。

2.光滑核膜型（AC—11）·AC—1与AC—11间期细胞都为均匀染色，但AC—11核周表现为光滑膜状增强染色，且可见相邻细胞接触部分荧光增强，而AC—1则无此表现。

在某些情况下，AC—1由于洗片过度或抗DNA抗体与核周围的异染色体发生反应，也可产生类似的核周连续环状荧光增强结构，但其荧光增强较AC—11宽，且观察其分裂期细胞荧光核型特征，AC—1染色体染色阳性，而AC—11阴性。

3.染色体型（AC—28）·AC—28分裂间期细胞染色阴性，而AC—1分裂间期细胞呈均匀荧光染色；分裂期细胞AC—28表现为染色体区荧光着色，且与中心区域相比周围通常具有颗粒或点状增强，而AC—1 分裂期细胞浓缩染色体呈均匀、透明的增强荧光。

4.Topo Ⅰ型（AC—29）·AC—29核仁呈颗粒样染色或外圈边缘有明显增强，且分裂期细胞染色体内有核仁组织区（nucleolus organizer regions，NOR）点状染色，而AC—1则无上述染色特征。

【相关靶抗原】

（一）双链DNA

1.生物学功能·基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）作为个体基因信息的载体存在于所有有核细胞中，它是由碱基、脱氧核糖和磷酸构成的DNA双螺旋结构，两条脱氧核糖核酸链的互补碱基朝向里面，脱氧核糖—磷酸链作为骨架在螺旋结构的外面。细胞中基因组DNA包裹在组蛋白（histone，H）及非组蛋白染色体蛋白中。两分子的H2A、H2B、H3和H4形成一个组蛋白八聚体，外周由146个DNA碱基对缠绕1.75圈，形成一个核小体的核心颗粒。核小体核心颗粒之间包裹在组蛋白H1中的“连接体”DNA（“linker”DNA）。组蛋白H1和“连接体”DNA共同组成核小体核心颗粒间的连接区，将核小体核心颗粒连接起来进而折叠形成串珠状染色体细丝。抗DNA抗体不同类型包括以下几种。

（1）抗DNA碱基抗体/抗骨架抗体/抗双螺旋抗体：抗DNA抗体是针对DNA不同组分所有抗体的总称，包括：①抗DNA碱基抗体（anti-bases），特异性识别DNA不同碱基（如鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶），但由于双链DNA互补碱基朝向里面，较难结合，通常为抗单链DNA（single strand deoxyribonucleic acid，ssDNA）抗体识别表位；②抗骨架抗体（anti-backbone），识别DNA磷酸和脱氧核糖骨架，该结构同时存在于ssDNA和双链DNA（double strand deoxyribonucleic acid，dsDNA）；③抗双螺旋抗体（anti-double helix），识别dsDNA双螺旋结构，其识别表位与抗ssDNA抗体无明显交叉反应。

（2）高/低亲和力抗dsDNA抗体：根据抗体与抗原结合强度，可分为高亲和力与低亲和力抗体。高盐条件孵育血清过程中，可抑制低亲和力抗dsDNA抗体的结合力，而且可能改变DNA的性质，但高亲和力抗体不受影响。

2.临床意义·抗dsDNA抗体是SLE特异性抗体，可检出于30％～70％ SLE患者，以及85％未经治疗的SLE患者，而少见于其他结缔组织病（connective tissue disease，CTD），因此该抗体被美国风湿病协会列为SLE诊断标准之一。

（1）参与SLE致病过程：dsDNA与抗dsDNA抗体形成的免疫复合物可沉积在肾脏、皮下和其他器官的毛细血管中，活化补体系统，引起器官病理损害。

（2）狼疮性肾炎和疾病活动度：抗dsDNA抗体通常与狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）相关，并且血清中抗dsDNA抗体含量与SLE疾病活动性相关，是疾病疗效监测的重要血清学标志物之一。此外，抗dsDNA抗体因亲和力高低不同而表现出与LN及SLE疾病活动度相关性的差异，高亲和力抗dsDNA抗体被认为对SLE特异性高，与LN及疾病活动性联系紧密；而低亲和力抗dsDNA抗体可存在于部分SLE患者疾病初期，且与SLE疾病活动性无关，除SLE以外还可出现于其他CTD或非自身免疫病患者中。

3.检测方法·临床实验室检测抗dsDNA抗体的方法包括：放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）、绿蝇短膜虫间接免疫荧光法（Crithidia Luciliae immunofluorescence test，CLIFT）、ELISA、CLIA、LIA和流式荧光法（表3—2—1）。

（1）RIA：因在样本制备过程中采用高盐溶液，因此主要检测血清中高亲和力抗dsDNA抗体，其高敏感性和特异性使得该种方法为公认的临床检测抗dsDNA抗体金标准。RIA检测抗dsDNA抗体结果已被纳入SLE活动性评分标准，即SLE疾病活动指数2000（SLE disease activity index 2000，SLEDAI—2K）［1］。

（2）CLIFT：该方法以绿蝇短膜虫为底物，观察其动基体（kinetoplast）荧光染色而检测抗dsDNA抗体。绿蝇短膜虫的动基体是一个经修饰的线粒体，具有高度致密的天然dsDNA而不含组蛋白，因此被认为是理想的抗dsDNA抗体靶抗原。CLIFT阳性对SLE高度特异，但敏感性低，仅20％～35％［2］。

（3）ELISA：因该方法可同时检测高、低亲和力抗dsDNA抗体，因此特异性低于CLIFT与RIA。目前已有部分商品化试剂盒通过核小体连接固相载体与dsDNA，而不再使用传统多聚亮氨酸或硫化鱼精蛋白作为连接物，使得该ELISA敏感性和特异性接近RIA［3］。

（4）CLIA：该方法检测抗dsDNA抗体被认为是同时考虑敏感性与特异性的优选方法（均为80％左右），且其检测结果与RIA相关性好［2］。

（5）LIA：LIA不推荐用于抗dsDNA抗体检测，其与ELISA一致性低，仅67.9％［4］。

（6）流式荧光法：一项基于中国SLE患者的研究表明，流式荧光法和通过核小体连接固相载体与dsDNA的新型ELISA试剂盒相比，具有相似的敏感性（流式荧光法，69.7％ vs ELISA，66.4％）和特异性（流式荧光法，86.7％ vs ELISA，85.0％）［5］。

上述方法中RIA、ELISA、CLIA和流式荧光法为定量检测方法。dsDNA参考血清有WHO提供的国际参考血清Wo/80（靶值：200 IU/ml）和15/174（靶值：100 IU/ml），其中前者已无法获得，后者可在www.nibsc.org/products/查阅信息。

（二）核小体

1.生物学功能·核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和H1、H2A、H2B、H3和H4等五种组蛋白构成。两分子的H2A、H2B、H3和H4形成一个组蛋白八聚体，外周由146个DNA碱基对缠绕1.75圈，形成一个核小体的核心颗粒。组蛋白H1和包裹在组蛋白H1内的“连接体”DNA（“linker”DNA）共同组成核小体核心颗粒间的连接区，将核小体核心颗粒连接起来进而形成串珠状染色体细丝。核小体有三个主要功能。

（1）DNA初级压缩，即每个核小体核心颗粒可压缩约200 bp的DNA。

（2）染色体的进一步压缩，即核小体可以自我组装成更高阶的染色体结构，从而进一步压缩基因组（10 000倍压缩）。

（3）作为染色体模板化过程的信号枢纽，为染色体酶的结合提供支架。其中的组蛋白经过不同形式的翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）可进一步调节染色体酶的招募，调节核小体稳定性，基因激活和染色体的高阶压缩。

2.临床意义

（1）SLE：抗核小体抗体（anti-nucleosome antibody，ANuA）是第一个被报道与SLE相关的自身抗体。SLE患者体内的狼疮细胞因子（lupus erythematosus cell factors）可作用于细胞膜，使细胞核膨大形成均匀无结构的圆形物质，当其被多形白细胞吞噬后，形成红斑狼疮细胞。核小体可抑制狼疮细胞形成，而dsDNA或组蛋白则无法抑制。因此，ANuA与“狼疮细胞现象”相关。另外，ANuA可在患者体内促进其他特异性抗核抗体的产生，如抗dsDNA抗体或抗组蛋白抗体，且循环中的核小体与ANuA形成复合物可沉积于肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）进而造成GBM局部炎症最终导致LN，因此ANuA在SLE发生发展过程中起重要作用。

ANuA作为SLE较为敏感和特异的分子标志物之一，大部分研究认为其优于抗dsDNA抗体。一项meta分析显示ANuA与抗dsDNA抗体敏感性分别为59.9％ vs.52.4％，特异性分别为94.9％ vs.94.2％［6］。

另外，ANuA对于抗dsDNA抗体阴性的SLE患者诊断具有重要价值，其在抗dsDNA抗体阴性的SLE患者中检出率为51％～60％［7—8］。ANuA滴度也与SLE活动性相关，且ANuA与抗dsDNA抗体双阳性患者相比其中任一抗体单阳性者更易发生严重的LN。

但是到目前为止，ANuA并未列入SLE诊断标准，这可能由于早期部分研究报道ANuA在SSc和混合性结缔组织病（mixed connective tissue disease，MCTD）患者中有较高检出率（SSc检出率，46％；MCTD检出率，45％［9］），但后续研究证实其检测ANuA所包被的核小体中存在拓扑异构酶Ⅰ（topoisomerase I，topo Ⅰ）的污染，从而造成ANuA在上述两种SARD中的高检出率。

（2）药物诱导性红斑狼疮：ANuA可在药物诱导性红斑狼疮（drug-induced lupus，DIL）患者中检出，其检出率因所用药物不同而存在差异，普鲁卡因胺引起的DIL检出率最高，肼屈嗪导致的DIL检出率较低。

3.检测方法·临床实验室检测ANuA的方法包括ELISA、CLIA及LIA等（表3—2—2），所包被的抗原依据制备方法不同主要有两种：一种是使用整个核小体颗粒，通常是在核心组蛋白或组蛋白二聚体中添加天然DNA而获得；另一种是通过微球菌核酸酶消化天然染色体，随后在中性pH下用0.5 mol/L NaCl萃取去除组蛋白H1、大多数非组蛋白蛋白质和RNA，只产生包裹DNA的核心组蛋白八聚体。两者比较，后者敏感性稍低（整个核小体颗粒，61％ vs.H1去除核小体，59％），但特异性明显提高（整个核小体颗粒，87.5％ vs.H1去除核小体，95.7％ ）［6］。LIA检测ANuA与ELISA有一定相关性（κ=0.64），对于临床高度怀疑SLE但LIA ANuA阴性的患者，建议采用ELISA进行复检。

（三）组蛋白

1.生物学功能·组蛋白是一组低分子量（分子量11.2～21.5 kDa）的阳离子蛋白，可分为两类，即核心组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）和连接组蛋白（H1和H5）。四个核心组蛋白具有相似的结构，包括保守的中心基序结构域（称为组蛋白折叠）和一个氨基末端尾部；此外核心组蛋白N端有一个基本区域，它穿过DNA延伸到核小体周围的空间，为多个组蛋白PTMs提供位置。连接组蛋白H1与核小体结合，促进多个核小体构建成紧密的染色体结构。连接组蛋白H5是H1在鸟类和鱼类中的变体，其中H1的许多赖氨酸被H5的精氨酸取代。

组蛋白的甲基化、乙酰化和其他转录后修饰在表观遗传基因表达中起着关键作用。组蛋白还是凋亡小体和中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps）的组成部分。凋亡特异性翻译后修饰组蛋白是SLE患者中抗组蛋白抗体（antihistone antibody，AHA）的主要靶抗原。

2.临床意义·AHA对于患者疾病诊断和预后预测的价值很小，其可检出于多种系统性或器官特异性自身免疫病，如DIL（90％～95％）、SLE（30％～70％）、RA（5％～50％）、幼年慢性关节炎［juvenile chronic arthritis，JCA（42％～50％）］、原发性胆汁性胆管炎［primary biliary cholangitis，PBC（60％～80％）］、自身免疫性肝炎［autoimmune hepatitis，AIH（35％～40％）］、PM/DM（17％ ～20％）和SSc（5％～45％）等［10］。

（1）药物性狼疮：组蛋白是核小体的关键组分，因此与ANuA相似，AHA也可引起DIL，检出率90％～95％，但其诊断价值低于ANuA。

（2）系统性红斑狼疮：AHA与SLE疾病活动性无关，但也有研究显示由于组蛋白H1是SLE患者B细胞和T细胞的重要自身抗原，抗组蛋白H1抗体对SLE高度特异且与其活动性相关［11］。另外，抗dsDNA抗体、ANuA和AHA三种抗体同时阳性与非三抗体阳性患者相比，易发生弥漫性增生性肾小球肾炎（proliferative glomerulonephritis），且这类患者病情缓解减少，复发率增加，预后较差［12］。

（3）多发性肌炎和皮肌炎：PM/DM患者中AHA主要以针对组蛋白H1的IgG抗体为主，且AHA阳性的PM/DM患者并发肺纤维化与恶性肿瘤比率明显降低［13］。

3.检测方法·临床实验室检测AHA的方法包括ELISA、CLIA和LIA等（表3—2—3）。科研实验室一般采用ELISA检测AHA后，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS—PAGE）后通过蛋白质免疫印迹（westernblot，WB）法区分不同类型组蛋白［13］，也可采用ELISA直接检测血清中抗组蛋白H1和H2B抗体（H2B是抗核心组蛋白的主要靶抗原）［11］。ELISA包被的抗原一般为牛胸腺分离纯化的组蛋白，经脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase I）处理以去除DNA污染。