2.3.3 可控切应力动物模型
给兔左颈总动脉施以硅胶管缩窄环扎手术（图2-5），形成局部狭窄血管模型，血流流场将发生明显改变，从而形成局切应力降低的区域。
兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠溶液（30 mg/kg）麻醉，至睫毛反射消失，仰卧位固定。沿颈部正中线自甲状软骨与胸骨之间切长约4 cm切口，逐层钝性分离皮下组织、颈部肌群，暴露气管。找到左侧颈动脉鞘，分离左侧颈总动脉中段长约2 cm，将灭菌的刻度尺与分离出的血管垂直放置于同一水平面，用数码相机照相，并迅速将照片输入电脑。在Windows画图软件中根据照片中血管旁刻度尺上刻度与血管直径所占距离比，很快能精确测量出血管直径，从而计算出预置某一狭窄度所需的硅胶管周径。选用内径为2 mm纵向剖开的医用硅胶管，根据需要裁剪出符合要求的周径，长度约8 mm，碘伏消毒3次，无菌生理盐水冲洗后套于左颈总动脉，4号手术丝线三重结扎固定。同法分离出右侧颈总动脉，不套硅胶管作为假手术对照，逐层缝合切口（图2-6）。根据术中测量的左颈总动脉直径大小分别施以30%、40%、50% 3个狭窄度的硅胶管环扎手术，从而形成局部血管不同的流场环境，使内皮细胞承受不同的切应力。
图2-5 兔颈总动脉狭窄模型示意图。［引自：刘华，等. 一种可控的切应力及 LDL 浓度极化动物模型的建立及对动脉粥样硬化的影响［J］. 第三军医大学学报，2009, 31（12）: 1981-1985.］
Figure 2-5 Schematic diagram of rabbit common carotid artery stenosis model. ［Adapted from: Liu H，et al. Establishment of controllable wall shear stress and LDL concentration polarization model in rabbits and their effect on atherosclerosis［J］. Acta Acad Med Mil Tert, 2009, 31（12）:1981-1985.］
图 2-6 兔左颈总动脉缩窄套环术。（a）左颈动脉套环前。（b）左颈动脉套环后。［引自：Liu H，et al. Establishment of controllable wall shear stress and LDL concentration polarization model in rabbits and their effect on atherosclerosis［J］. Acta Acad Med Mil Tert, 2009, 31（12）: 1981-1985.］
Figure 2-6 Rabbit left common carotid artery coarctation loop. （a）Before the left carotid artery loop. （b）After the left carotid artery loop. ［Adapted from: Liu H, et al. Establishment of controllable wall shear stress and LDL concentration polarization model in rabbits and their effect on atherosclerosis［J］. Acta Acad Med Mil Tert, 2009, 31（12）: 1981-1985.］
术后给予青霉素40万U/d肌内注射3～5 d预防感染。每天定量饲喂饲料150 g，饲养8周。根据试验分组分别饲以4种饲料：0%胆固醇饲料（普通饲料）、0.5%胆固醇饲料（0.5%胆固醇+5%猪油+基础饲料）、1%胆固醇饲料（1%胆固醇+5%猪油+基础饲料）、1.5%胆固醇饲料（1.5%胆固醇+5%猪油+基础饲料）。通过饲喂含不同浓度胆固醇的饲料从而形成血流系统中不同的LDL浓度极化程度。
采用美国GE公司的LOGIQ400彩色多普勒超声血流显像仪（color Doppler flow imaging，CDFI）测量饲喂8周后兔的各项血流动力学参数。先行二维彩色血流分布特征检测颈动脉，确定血管走行方向，然后测定舒张末期血管内径Dr、收缩末期血流速度（VSP）、舒张末血流速度（VED）、平均血流速度（Vm），阻力指数（RI）、搏动指数（PI）。左侧颈总动脉为狭窄侧，右侧作为对照。每侧血管相关参数测定10次，最后取平均值。术前及术后4、8周兔耳缘静脉采血，Sapphire 600型全自动生化分析仪测量血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride）、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白。FASCO-2050A型全自动血液流变快测仪测定术后8周各组动物全血黏度值。
根据公式
计算血管壁面切应力（wall shear stress，WSS），τm为血流平均切应力，η为血液黏度值，Vm为平均血流速度，Dr为舒张末期血管内径。同一狭窄度的左颈总动脉（left common carotid artery，LCCA），随饲喂胆固醇浓度的增加，血液黏度增加，切应力随之增加；对于饲喂含同一胆固醇浓度饲料的组别而言，LCCA血液平均流速在40%狭窄度组较低，切应力在该狭窄度也最低；LCCA因行硅胶管缩窄手术且有内膜增厚等AS病变，血管内径显著变小，切应力较对照侧右颈总动脉（right common carotid artery，RCCA）显著高（p＜0.01）（表2-1）。(https://www.daowen.com)
表2-1 各组动物左右颈总动脉切应力值/（dyn·cm-2）
Table 2-1 The shear stress value of the left and right common carotid arteries of each group of animals/（dyn·cm-2）
注：a：与同一狭窄度RCCA比较，p＜0.01。
对各组实验动物双侧颈总动脉标本行扫描电镜检测发现，各组动物LCCA均出现不同程度的AS病变，表现为内膜增生，斑块形成，局部内皮细胞排列紊乱、脱落、斑块表面纤维组织增生等病变，对照侧RCCA内皮细胞排列整齐，未见明显斑块形成。各组动物中，以40%狭窄组病变尤为显著（图2-7）。
图2-7 扫描电子显微镜观察各组动物双侧颈总动脉病变情况。（a）30%狭窄+0%胆固醇组RCCA内皮细胞排列整齐，无斑块形成。（b）40%狭窄+1%胆固醇组RCCA管腔光滑无斑块增生。（c）40%狭窄 +0.5% 胆固醇组LCCA斑块表面纤维增生，未见明显内皮细胞。（d）40%狭窄+1%胆固醇组LCCA血管腔内见显著增生斑块，管腔狭窄。［引自：Liu H, et al. Establishment of controllable wall shear stress and LDL concentration polarization model in rabbits and their effect on atherosclerosis［J］. Acta Acad Med Mil Tert. 2009, 31（12）: 1981-1985.］
Figure 2-7 Scanning electron microscope observation of bilateral common carotid artery lesions. （a）endothelial cells of RCCA arrange neatly, and no plaque formed in the group of 30% stenosis +0% cholesterol. （b）Smooth lumen of RCCA and without plaque hyperplasia in the group of 40% stenosis +1% cholesterol. （c）Fibrous proliferation on the surface of LCCA plaque and no obvious endothelial cells in the group of 40% stenosis +0.5% cholesterol. （d）Significant proliferative plaques and lumen stenosis were seen in the lumen of LCCA vessels in the 40% stenosis +1% cholesterol group.［Adapted from: Liu H, et al. Establishment of controllable wall shear stress and LDL concentration polarization model in rabbits and their effect on atherosclerosis［J］. Acta Acad Med Mil Tert. 2009, 31（12）: 1981-1985.］
病理切片光学显微镜下观察，发现各组动物LCCA均有不同程度的AS病变形成，局部血管壁出现大量泡沫细胞、黏液变性、脂质聚集、弹力纤维和血管壁平滑肌细胞排列紊乱、血管内膜变性坏死、血栓形成、斑块形成等病变；而对照侧RCCA内膜光滑完整，无斑块形成，仅有个别血管局部有灶性泡沫细胞出现。各组动物中，均以40%狭窄组病变尤为显著（图2-8）。
建立稳定可靠的动物模型是动物实验的基础和开展相关研究的重要环节，目前颈动脉狭窄模型的制作方法有外科手术丝线结扎法，球囊损伤法干燥空气损伤法，化学物质烧灼内膜法等，但以上方法均会造成血管内膜或血管壁的损伤。而对于狭窄度的确定，大多都是应用术后数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）或者血管内超声（intravascular ultrasound，IVUS）等检测方法，能够较好地确定狭窄血管的狭窄度，但存在程序多，操作复杂，不能随意设定狭窄度等缺点。我们在本章实验中使用硅胶管套扎左颈总动脉，具有生物相容性好，不损伤血管内膜的优点。另外在模型中采用手术期间数码照相结合计算机软件测量的方法，可以精确测量血管直径，根据颈总动脉直径的大小现场制作符合要求的硅胶管，使得狭窄度的确定简单快速且较为精确，从而使预设的狭窄度可以精确调控。该方法稳定可靠，简单易行，狭窄血管的长度和狭窄度可自由设定和调控，可以快速地制作AS动物模型对切应力变化与AS病变的关系进行在体研究。
图2-8 颈动脉病理学观察。（a）40%狭窄+0.5%胆固醇组LCCA（HE×100）管腔斑块形成，↑：内膜下见脂质聚集及胆固醇结晶。（b）40%狭窄+0.5%胆固醇组RCCA（HE×100）。（c）50%狭窄+1. 5%胆固醇组LCCA（HE×100）管腔血栓形成并机化后再通。（d）30% 狭窄+1.5%胆固醇组RCCA（HE×200），↑：平滑肌细胞间见散在泡沫细胞。［引自：Liu H, et al. Establishment of controllable wall shear stress and LDL concentration polarization model in rabbits and their effect on atherosclerosis［J］. Acta Acad Med Mil Tert, 2009, 31（12）:1981-1985.］
Figure 2-8 Pathological observation of carotid artery. （a）plaque formation in LCCA lumen of 40% stenosis +0.5% cholesterol（HE×100）, ↑：Lipid aggregation and cholesterol crystals in the intima. （b）The RCCA in the group of 40% stenosis +0.5% cholesterol （HE×100）. （c）The thrombosis was formed and recanalized after mechanization in the group of 50% stenosis +1.5% cholesterol. （d）The RCCA in the group of 30% stenosis +1.5% cholesterol （HE×100）, ↑: Foam cells scattered among the smooth muscle cells. ［Adapted from: Liu H, et al. Establishment of controllable wall shear stress and LDL concentration polarization model in rabbits and their effect on atherosclerosis［J］. Acta Acad Med Mil Tert, 2009, 31（12）:1981-1985.］
我们在本章实验中利用兔左颈总动脉硅胶管环扎术及术后高脂饮食快速制作AS动物模型，通过施以3种狭窄度的硅胶管套环术，形成局部狭窄血管不同的流场环境，使血管壁承受不同的切应力，从而使局部血管切应力成为可调控的因素。实验结果表明不论哪种饲料喂养的动物，相同饲料的组别中，都是40%狭窄度组的切应力最低，而病理形态学检测以及扫描电镜的结果也证实了40%狭窄度组AS病变最为显著（图2-7、图2-8），由此说明低切应力诱导和促进了AS的形成和发展。