7.1.2 动物模型处理结果
使用Image J软件对图像数据分析处理；以平均数±标准差表示实验结果，采用GraphPad Prism v 7.04软件分析实验数据，检测各组之间是否存在统计学差异。
（1）染色病理形态学观察
1）HE染色：将冰冻切片取出，用10%甲醛固定5 min，流水冲洗2 min后再用蒸馏水浸泡3 min；在目标切片处滴加苏木精染料，染色2 min后用自来水快速冲洗；随后用0.5%盐酸乙醇脱色2 s后用蒸馏水快速冲洗；滴加0.25%氨水直至组织变蓝后用自来水冲洗1 min。光镜下观察细胞核分色情况；用1%伊红染料染色1 min后用蒸馏水快速冲洗；分别用80%、90%、95%乙醇冲洗玻片15 s。光镜下观察细胞核与细胞质的颜色；用100%乙醇脱色2次，每次2 min；滴加二甲苯增强表本折光率，滴加2次，每次2 min。HE染色后的图片如图 7-1（a）所示，从图中可以观察到损伤段血管形态与正常组血管形态差异明显。对兔左侧颈总动脉进行球囊损伤术后1个月后，损伤段血管中膜平滑肌细胞大量增殖，出现较为明显的内膜增厚，而未做损伤处理的右侧颈总动脉，血管内细胞形态正常，中膜中的弹力板结构完整，排列整齐，血管内膜无增厚。根据HE染色图片，测量得到正常组和实验组颈总动脉血管内膜厚度统计结果（图7-1（c））。可以看出，内膜损伤段血管内膜厚度与正常组相比出现显著性增厚（p＜0.01）。
2）MASSON染色：取适量的Weigert铁苏木素A液和Weigert铁苏木素B液等量混合为Weigert铁苏木素染色液。滴加染色液到切片的标本上，染色2 min后用流水稍微冲洗；用酸性乙醇分化液对样本进行分化5 s，流水冲洗2 min；滴加蓝化液对标本进行返蓝5 s，流水冲洗2 min；用丽春红品红染色液染色，2 min后用流水冲洗1 min；配制乙酸工作液，将蒸馏水和乙酸溶液按比例配制，用现配的乙酸工作液冲洗切片；滴加磷钼酸溶液，浸过标本后倾去；用苯胺蓝染色液复染，倾去染色液；再用乙酸工作液处理切片，光镜下观察；直到光镜下观察到样本无蓝色脱出后用乙醇脱水。95%乙醇迅速脱水，无水乙醇脱水3次。MASSON染色后的图片如图7-1（b）所示，同样可以观察到损伤段血管形态与正常组血管形态差异明显。对兔左侧颈总动脉进行球囊损伤术后1个月后，损伤段血管中膜弹力板间分布大量的胶原纤维，分析认为球囊损伤刺激血管中膜平滑肌细胞大量分泌胶原蛋白，而胶原蛋白的降解速度较慢，因此进一步促进了内膜增厚，而未做损伤处理的右侧颈总动脉，血管内细胞形态正常，中膜中的弹力板结构完整，排列整齐，血管内膜无增厚。
图7-1 兔颈总动脉染色结果。（a）HE染色。（b）MASSON染色。（c）血管新生内膜厚度（n=6），**p＜0.01。［引自：He S, et al. Effects of different positions of intravascular stent implantation in stenosed vessels on in-stent restenosis: An experimental and numerical simulation study［J］. J Biomech, 2020, 113: 110089.］
Figure 7-1 Staining results of carotid artery in rabbits.（a）HE staining.（b）MASSON staining.（c）Neointimal thickness（n=6）, **p＜0.01.［Adapted From: He S, et al. Effects of different positions of intravascular stent implantation in stenosed vessels on instent restenosis: An experimental and numerical simulation study［J］. J Biomech, 2020, 113: 110089.］(https://www.daowen.com)
（2）动物模型影像数据
1）兔颈动脉CTA测量：兔子球囊损伤术后喂养高脂饲料5周，然后进行计算机断层造影（computed tomography angiography，CTA）检测以验证颈动脉狭窄模型。常规的计算机断层扫描（computed tomography，CT）对人体内高密度的组织具有较好的成像效果，但对密度较低的组织和器官如血管显像效果较差，通过配合血管造影，CTA可以将血管的细节特征清晰地显示出来。实验前对动物禁食1天，实验当天首先对兔子进行称重，按0.25 mL/kg的剂量肌内注射陆眠宁，待兔子四肢肌肉完全松弛后，按2.5 mL/kg的剂量腹腔注射10%水合氯醛。待兔子完全麻醉后，将静脉留置针沿兔子耳缘静脉扎入，留置针连接CT机显影导管，并按4 mL/kg的剂量并保持0.7 mL/s的速度注射造影剂，随后便可进行CT扫描，本实验使用的CT机为联影公司生产的64排128层螺旋CT机，层扫厚度为0.625 mm。兔子被放置在CT扫描通道上等待扫描的图像数据如图7-2（a）所示。图7-2（b）为经过球囊损伤处理的左侧颈动脉，蓝框内为血管损伤区域，可见该处组织有显著损伤，血管出现一定程度狭窄，结合切片染色数据可认为兔颈动脉狭窄模型构建成功。
2）兔颈动脉多普勒超声测量：多普勒超声简称D型超声诊断，具有安全无创，操作简便，费用较低等优势，并可对脏器的运动和功能进行连贯的观测，是临床上利用超声检测脏器的解剖结构和某一深度血流信息的重要检测手段。在对兔子采集完CTA影像数据后，需对兔子颈动脉进行多普勒超声扫描，以获取损伤血管区域血液流速数据。超声测量使用了Vevo 2100型彩色多普勒超声仪，测量结果如图7-2（c）所示，超声影像反映了兔子颈动脉血液多个心动周期内的血流速度变化波形，红色区域为超声设备渲染的血液部分，从图中可以看出该实验动物心率较高，单个心动周期约为0.24 s，心率约为215次，收缩期末峰值流速约为400 mm/s。将超声获取的图片数据导入Solidworks软件，利用样条曲线拟合出3个心动周期内（约0.84 s）的血流波形，将拟合的曲线以图片格式导入Getdata软件后，坐标值根据超声测量时选定点数值设定，横坐标增量设置为0.002 s，区域化选区后原始曲线被离散成420个数据点，获取的入口流速数据作为计算模型入口血液流速值，如图7-2（d）所示为Matlab根据入口流速数值绘制的血流波形。
3）兔颈动脉OCT测量：血管内光学相干断层造影（optical coherence tomography，OCT），是近些年继CT，核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）之后发展起来的一种新型成像技术，该技术利用可见光的高分辨率，可以对生物组织表层形貌进行极高空间分辨率三维扫描，相较于CT对人体无任何辐射影响，且规避了MRI不能扫描金属类样品的弊端，但存在探测深度小的缺点。实验动物在植入支架4周后对其植入支架血管段进行OCT测量，实验中提前处死动物并取出支架植入段血管进行离体扫描。OCT测量使用的设备为美国圣犹达医疗用品公司的产品C7-XR，测量结果如图7-2（e）所示，可以清晰地看到支架植入到血管后管腔内壁轮廓，高亮区域为血管壁，由于支架不透光，图中阴影区域为支架丝遮光造成的。该OCT设备的光纤传感器移动速度为15 mm/s，系统采样频率为150 Hz，对于长度为30 mm的单个血管样本，类似的横切图片约有300张，层切厚度约为0.1 mm，可以很好地反映支架植入后血管局部的几何特征。对每个样本图像进行处理，选取了其中几何特征较为显著的40余张截面，首先将每张图像的血管管腔轮廓线提取出来，在Solidworks里将各个轮廓线沿中心点对齐并做空间阵列，随后通过放样操作完成几何模型重建，重建过程和几何模型如图7-2（e）所示。
图7-2 兔子颈部影像。（a）麻醉后准备进行CT扫描的兔子。（b）兔子左颈动脉的原始CTA数据。（c）多普勒超声测量。（d）超声得出的颈动脉流速波形。（e）基于OCT数据的三维模型重建。［引自：He S, et al. Effects of different positions of intravascular stent implantation in stenosed vessels on in-stent restenosis: An experimental and numerical simulation study［J］. J Biomech, 2020, 113: 110089.］
Figure 7-2 Neck images of rabbit.（a）a rabbit prepared to CT scanning after anesthesia.（b）raw CTA data of the rabbit’s left carotid artery.（c）Doppler ultrasound measurement.（d）flow velocity waveform in the carotid artery derived from ultrasound.（e）Three-demensional model reconstruction on the basis of the OCT data.［Adapted from: He S, et al. Effects of different positions of intravascular stent implantation in stenosed vessels on in-stent restenosis: An experimental and numerical simulation study. J Biomech［J］, 2020（113）: 110089.］