8.4.1 转录组测序预测Hippo/YAP可能参与ATO调节VSMCs的表型
Hippo/YAP途径在已知的诸多调节VSMCs表型开关相关因子等信号通路中有重要作用。近期研究报道，PI3Kγ可通过3＇ 5＇-环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）反应元件结合蛋白CREB/YAP来调控VSMCs表型转化和新生内膜形成。其中，cAMP又可以通过诱导细胞骨架重构促使YAP出核、活性降低等从而抑制VSMCs相关促分裂基因的表达。
本课题组提取原代猪冠状动脉平滑肌细胞（PCASMCs），利用第3代PCASMCs作为研究对象进行RNA转录组测序。未做处理的为收缩型平滑肌细胞（SS），经PDGF（10 ng/mL）处理后的为合成型平滑肌细胞（SH）。用ATO（2 μM）分别处理合成型和收缩型VSMCs 8 h后，收集总RNA样本，送交公司行转录组测序分析（图8-6（a））。使用维恩图分析两种类型平滑肌细胞受到ATO刺激后的差异基因，其结果表明，除2 916个基因属于相同的变化基因外，还有4 837个基因是两种表型SMCs对ATO响应的差异基因（图8-6（b））。利用基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析，发现ATO处理后，收缩型和合成型PCASMCs在细胞代谢、细胞周期等细胞过程的基因具有显著差异（图8-6（c））。
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图8-6 转录组测序分析及qPCR实验（对有或没有ATO处理8小时的收缩型和合成型平滑肌细胞进行RNA基因组测序分析，并对基因和信号进行qPCR验证）。（a）PCASMCs的表型诱导和ATO处理的示意图。（b）维恩图。（c）基因本体论（GO）富集分析。（d）和（e）分别为ATO处理后的相关细胞过程（d）和主要表达基因（e）的变化统计表。（f）利用qPCR检测A7r5细胞中α-SMA、Calponin、RhoA、ROCK及YAP的表达情况。SS0：未经ATO处理的收缩型PCASMCs；SS2：收缩型PCASMCs经2 μmol/L ATO处理8 h；SH0：未经ATO处理的合成型PCASMCs；SH2：合成型PCASMCs经2 μmol/L ATO处理8 h。［引自：Zhao Y, et al. A novel mechanism of inhibiting in-stent restenosis with arsenic trioxide drug-eluting stent: enhancing contractile phenotype of vascular smooth muscle cells via YAP pathway［J］. Bioact Mater, 2021, 6（2）: 375-385.］
Figure 8-6 Transcriptome sequencing analysis and qPCR experiments（RNA genome sequencing analysis of contractile and synthetic PCASMCs with or without ATO treating for 8 h, and qPCR validation of genes and signals）.（a）The schematic diagram for the phenotype induction and ATO treating of PCSMCs.（b）Venn diagram.（c）Gene Ontology（GO）enrichment analysis.（d）and（e）are the statistical tables of changes in ATO treatment, related cell processes（d）and main gene expression（e）of synthetic PCASMCs（SH2 vs SH0）.（f）qPCR of α-SMA, Calponin, RhoA, ROCK and YAP for A7r5. SS0: contractile PCASMCs without ATO treatment; SS2: contractile PCASMCs treated with 2 μmol/L ATO for 8 h; SH0: synthetic PCASMCs without ATO treatment; and SH2: synthetic PCASMCs treated with 2 μmol/L ATO for 8 h. A0, A2, A4 and A6 represent 0, 2, 4 and 6 μmol/L of ATO, respectively. ［Adapted from: Zhao Y, et al. A novel mechanism of inhibiting in-stent restenosis with arsenic trioxide drug-eluting stent: enhancing contractile phenotype of vascular smooth muscle cells via YAP pathway［J］. Bioact Mater, 2021, 6（2）: 375-385.］
随后，我们以合成型PCASMCs为研究对象，进一步将ATO处理前后，SH0和SH2具有差异表达的细胞过程进行分析，发现ATO对合成型PCASMCs中细胞凋亡、Hippo信号、肌动蛋白细胞骨架和血管收缩等细胞过程有上调作用；而对细胞周期、DNA复制和TCA循环等细胞过程有下调影响（图8-6（d））。相比SH0来说，SH2组中的凋亡相关基因、肌动蛋白骨架相关基因、血管平滑肌收缩相关基因等多数表达上调，但细胞迁移相关基因却有表达下调趋势。换言之，ATO处理可促进合成型PCASMCs的细胞凋亡、抑制细胞迁移；另外，促进部分肌动蛋白骨架基因和平滑肌细胞收缩表型基因的表达。正反两方面均暗示：ATO可以诱导PCASMCs由合成型向收缩型的转化。
由RNA测序得出：两种表型的VSMCs在ATO处理后基因表达有显著差异；且ATO可以上调合成型VSMCs中的Hippo信号、促进肌动蛋白细胞骨架聚集和诱导血管收缩等与YAP信号密切相关的细胞过程。然后利用A7r5平滑肌细胞进行了qPCR实验，检测与细胞收缩、细胞骨架及Hippo信号通路相关基因（α-SMA、Calponin、RhoA、ROCK和 YAP）的表达情况，数据证实了RNA测序的预测结果。