6.1 低震荡切应力模型血管的蛋白组学分析
蛋白质组学是以特定环境下的特定组织的全套蛋白质为研究对象，研究内容包括蛋白质分析鉴定、表达水平、翻译后修饰、蛋白质功能、蛋白质相互作用等，用以鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制。本节通过ApoE-/-小鼠颈动脉低震荡切应力模型（图6-1），应用蛋白组技术研究不同切应力下血管蛋白的表达差异情况，并且通过GO分析及KEGG信号通路分析方法分析差异表达蛋白可能参与的信号通路及引起的生物学效应，这将有助于更深入的了解血流动力学如何影响动脉粥样硬化的发生发展。
图6-1 ApoE-/-小鼠颈动脉结扎模型示意图［引自：张康.Id1调控脂质吸收参与动脉粥样硬化斑块形成的力学生物学机制［D］. 重庆:重庆大学, 2018.］
Figure 6-1 Schematic diagram of carotid artery ligation model in ApoE-/-mice［Adapted from: Zhang K. The mechanogical mechanisms of Id1-regulated lipid uptake in atherosclerosis plaque formation［D］. Chongqing: Chongqing University, 2018.］
对ApoE-/-小鼠进行左颈动脉结扎手术处理并喂养48 h过后，使用小动物超声仪（VisualSonics，Canada）检测小鼠左颈总动脉（left carotid artery, LCA）和右颈总动脉（right carotid artery, RCA）的血流流速。结果如图6-2 所示，左颈动脉血液出现两个呈相反方向的血流，即形成低震荡流（LCA1和LCA2），此时血管内的切应力为往复的低震荡切应力，而右侧颈动脉为单一方向的层流，血管内的切应力为层流切应力。并且左颈动脉血流流速低于右颈动脉，统计结果如图6-2（b）所示。由此结果说明小鼠低震荡切应力模型构建成功。
将2个名为LCA（OSS）以及 RCA（LSS）的小鼠样品进行同位素标记定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）鉴定。最终将差异表达蛋白定义为1.5倍变化（比较组的平均值）和p值（比较组的t检验）小于0.05。经分析LCA（OSS）与 RCA（LSS）相比有168个差异表达蛋白，其中有18个蛋白表达下调，150个蛋白表达上调，结果见表6-1。
对差异蛋白进行GO富集和 KEGG pathway富集分析，试图找到其可能涉及的生物学过程及相关信号通路。对差异表达蛋白进行了GO功能注释及功能富集，除去未被标记注释的蛋白外，其他差异表达蛋白显著富集到46个细胞成分中（corrected p-value＜0.05），其中最富集的6个GO 分析组见表6-2：大分子复合物（macromolecular complex）、非膜包裹细胞器（non-membrane-bounded organelle）、胞内非膜包裹细胞器（intracellular non-membranebounded organelle）、胞外区域（extracellular region）、细胞质（cytosol）、核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein complex）；分子功能分析中，见表6-3，差异蛋白最富集的10个GO-terms是：分子结构活性（structural molecule activity）、核糖体结构组成（structural constituent of ribosome）、核酸结合（nucleic acid binding）、RNA结合（RNA binding）、酶调节剂活性（enzyme regulator activity）、酶抑制剂活性（enzyme inhibitor activity）、糖胺聚糖结合（glycosaminoglycan binding）、糖衍生物结合（carbohydrate derivative binding）、肝素结合（heparin binding）、硫化合物结合（sulfur compound binding）；生物过程分析中，差异蛋白显著富集在452个生物过程中（corrected p-value＜0.05），最富集的10个生物过程见表6-4，包括：单一生物过程（single-organism process）、大分子代谢过程（macromolecule metabolic process）、细胞组分构建或生物发生（cellular component organization or biogenesis）、响应刺激（response to stimulus）、定位（localization）、蛋白质代谢过程（protein metabolic process）、运输过程（transport）、氮化合物代谢过程（nitrogen compound metabolic process）、单体运输（single-organism transport）、细胞蛋白质代谢过程（cellular protein metabolic process）等。
图6-2 结扎模型手术后48 h可以诱导低震荡切应力形成。（a）结扎48 h后，通过小动物超声检测右颈动脉（RCA）及左颈动脉（LCA）血管内血液情况。（b）统计分析RCA及LCA的血流流速大小（n=3）。**p＜0.001表示与RCA相比有显著差异。［引自：张康.Id1调控脂质吸收参与动脉粥样硬化斑块形成的力学生物学机制［D］. 重庆:重庆大学, 2018.］
Figure 6-2 The ligation model can be induced OSS 48 hours later after partial ligated.（a）Ultrasonography was used to detect the right and left carotid artery blood flow velocities 48 hours after ligation.（b）Statistical analysis of blood flow velocity of RCA and LCA（n=3）. **p＜0.001 indicates a significant difference compared to RCA .［Adapted from: Zhang K. The mechanogical mechanisms of Id1-regulated lipid uptake in atherosclerosis plaque formation［D］. Chongqing: Chongqing University, 2018.］
表6-1 差异表达蛋白信息
Table 6-1 Differentially expressed proteins information
表6-2 差异表达蛋白最富集的6个细胞组分
Table 6-2 Differentially expressed proteins were the most enriched in six cellular components（p-value＜0.05）
表6-3 差异表达蛋白最富集的10个分子功能
Table 6-3 Differentially expressed proteins were the most enriched in ten molecular functions（p-value＜0.05）(https://www.daowen.com)
表6-4 差异表达蛋白最富集的10个生物过程
Table 6-4 Differentially expressed proteins were enriched in these biological process terms（p-value＜0.05）
KEGG信号通路分析发现差异表达蛋白显著富集于20个信号通路中（corrected p-value＜0.05），结果图6-3所示，其中补体及凝血途径（complement and coagulation cascades）、造血（hematopoietic cell lineage）、吞噬（phagosome）、脂肪消化与吸收（fat digestion and absorption）、矿物质吸收（mineral absorption）、细胞黏附分子（cell adhesion molecules）等信号通路与动脉粥样硬化发生发展密切相关，这说明OSS可能通过这些途径影响了AS的形成。
由于脂质代谢过程对AS形成至关重要，我们对小鼠颈动脉血管切应力进行干预后发现许多脂质消化吸收相关因子表达发生变化，如ApoA-Ⅰ、ApoA-Ⅳ表达上调，CD36表达下调，结果如图6-4所示，红色为表达上调的蛋白，绿色为表达下调的蛋白。除此之外，我们还发现低震荡切应力可以促进凝血酶敏感蛋白1（TSP1）表达（图6-5），这与Tressel等人对内皮细胞体外力学加载后蛋白组研究结果相符合。
TSP1是一个胞外基质糖蛋白，血管内皮细胞、单核细胞等许多正常及肿瘤细胞中都能检测到其表达。有研究显示TSP1是Id1蛋白的下游靶点，Id1蛋白可以抑制TSP1的表达；我们的蛋白组鉴定结果显示OSS促进TSP1蛋白表达，KEGG信号通路分析发现Id1蛋白可以抑制TSP1蛋白表达，参与RAP1信号通路过程（图6-7）；Ni等对LSS及OSS下血管的内皮细胞基因进行微阵列分析后发现OSS抑制血管内皮细胞中Id1基因的表达。通过前人的研究与我们的结果相结合，得出一种可能性，即OSS抑制血管内皮细胞中Id1蛋白的表达进而促进其下游蛋白表达。
血管壁由内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞以及胞外基质组成。切应力作用于血管壁时，内皮细胞一方面可以直接感受力学信号并将信号传入胞内从而影响其功能，另一方面在感应力学刺激后还可以通过释放一些生长因子影响平滑肌细胞及胞外基质，从而使血管壁结构发生变化。切应力相关的蛋白组研究大多集中在体外培养的血管及内皮细胞力学加载后的检测上，本章研究考虑到血管是一个整体，力学变化会引起血管各个细胞及胞外基质发生变化，因此，我们通过手术手段改变小鼠颈动脉血管内的切应力后，提取了整根血管的蛋白进行差异蛋白组分析，这可以帮助我们以全局视角去了解整个血管受OSS刺激后差异表达蛋白所引起的生物学效应。
图6-3 差异表达蛋白的KEGG信号通路分析［引自：张康.Id1调控脂质吸收参与动脉粥样硬化斑块形成的力学生物学机制［D］. 重庆:重庆大学, 2018.］
Figure 6-3 Differentially expressed proteins were analyzed by KEGG pathway［Adapted from: Zhang K. The mechanogical mechanisms of Id1-regulated lipid uptake in atherosclerosis plaque formation［D］. Chongqing: Chongqing University, 2018.］
图6-4 差异表达蛋白参与脂质消化及吸收过程。红色框为表达上调的蛋白，绿色框为表达下调的蛋白。（ApoA-Ⅰ/Ⅳ:载脂蛋白A-Ⅰ/Ⅳ，参与脂质的代谢和运转，与动脉粥样硬化密切相关；CD36：白细胞分化抗原36，是一种高度糖基化的单链跨膜蛋白,属B型清道夫受体，参与动脉粥样硬化病变过程）［引自：张康.Id1调控脂质吸收参与动脉粥样硬化斑块形成的力学生物学机制［D］. 重庆:重庆大学, 2018.］
Figure 6-4 Differentially expressed proteins were involved in fat digestion and absorption. The red boxes are the up-regulated proteins and the green box is the downregulated protein（ApoA-Ⅰ/Ⅳ: apolipoprotein A-Ⅰ/Ⅳ, involued in lipid metabolism and operation, closely related to atherosclerosis; CD36: leukocyte differentiation antigen 36, which is a highly glycosylated single-chain transmembrane protein, a type B scavenger receptor, involved in the process of atherosclerotic lesions）.［Adapted from: Zhang K. The mechanogical mechanisms of Id1-regulated lipid uptake in atherosclerosis plaque formation［D］. Chongqing: Chongqing University, 2018.］
图6-5 差异表达蛋白参与RAP1信号通路过程。红色框为表达上调的蛋白。黄色框为受Id1调控的蛋白。（TSP1：血小板反应蛋白；Ras:属于三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋白,在传递细胞生长分化信号方面起重要作用；Integrin：整联蛋白，介导细胞间黏附）［引自：张康.Id1调控脂质吸收参与动脉粥样硬化斑块形成的力学生物学机制［D］. 重庆:重庆大学, 2018.］
Figure 6-5 Differentially expressed proteins were involved in RAP1 signaling pathway. The red boxes are the up-regulated proteins, and the yellow box is the protein regulated by Id1.［Adapted from: Zhang K. The mechanogical mechanisms of Id1-regulated lipid uptake in atherosclerosis plaque formation［D］. Chongqing: Chongqing University, 2018.］