3.4.2　转基因内皮细胞修饰血管内支架

VECs在再狭窄形成过程中的作用越来越受到重视。血管内支架置入人体内很难见到自发性的内皮化，单纯的内皮细胞种植血管内支架，由于内皮细胞分裂增殖速度非常缓慢，因而支架上内皮细胞脱落处不能得到迅速的重新内皮化，且长时间与血流接触有致血栓形成的危险，而且对损伤的内膜无促进修复的作用，对支架内再狭窄的防治难起作用。此外转染基因种类、转染方法和不同物种来源细胞对转染后细胞功能特别是与黏附保留功能的影响研究目前尚无定论。VECs移植能替代、修复受损内皮的功能并抑制内膜过度增生。体外培养的内皮细胞由于生长环境的改变，导致生长缓慢和其他生物特性的丢失。结合基因治疗，有望通过对体外培养的内皮细胞稳定转染生长因子，提升细胞的增殖能力。结合动态培养，有望促进内皮细胞在血管内支架表面的黏附和生长。

我们对人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）稳定转染VEGF121；设计并制作了用于血管内支架表面种植细胞的旋转培养装置，通过对旋转速度、旋转时间、细胞种植密度和重复旋转的次数这些影响因素的分析，找出了黏附效果最好的条件组合。用超声雾化喷涂法方法制备用于细胞黏附的蛋白涂层，并用扫描电镜和能谱测试仪检测制备好的蛋白涂层。根据得到的最佳旋转培养条件制作转基因内皮细胞涂层支架，通过扫描电镜检测，旋转培养后血管内支架表面黏附的细胞数量和铺展情况，免疫荧光检测支架表面黏附的细胞表达VEGF因子的情况。体外流动腔实验检测经过传输的损耗和流动切应力的作用后，转染VEGF基因的HUVECs在血管内支架表面的黏附和生长情况；最后通过兔腹主动脉支架植入术的动物模型检测转基因内皮细胞涂层支架的抗再狭窄和抗血栓的效果。通过对旋转速度、旋转时间、细胞种植密度和重复旋转的次数这些影响因素的分析，寻找出了黏附效果最好的条件组合，当细胞种植密度为1×105cells/mL，旋转时间为6 h，旋转速度为0.4 rpm时，旋转培养黏附的细胞数量最多；制备明胶浓度为2～ 6 μg/mL，多聚赖氨酸为10 μg/mL的混合溶液，用超声雾化喷涂法方法得到的蛋白涂层经检测在支架表面涂覆紧密、均匀；通过优化的旋转培养条件制备出转基因内皮细胞覆盖的血管内支架，光学显微镜和扫描电镜下观察，细胞在支架表面黏附生长状态良好，荧光显微镜检测高表达VEGF蛋白的细胞。经体外流动腔实验检测发现，转基因内皮细胞在模拟体内传输过程中，将有部分细胞丢失，但是在不同的切应力作用下，细胞可以很快地恢复生长。动物实验结果发现与两个对照组相比，细胞涂层支架均极显著的抑制了内膜增生和降低了支架内再狭窄。转基因内皮细胞修饰血管内支架的制备及动物实验结果如图3-5所示。本研究初步解决了血管内支架的细胞种植方法，提出一种组织工程血管内支架的实验室制备方法和检测方法，得到的相关实验结果为细胞种植防治血管内支架再狭窄的临床应用提供实验依据。(https://www.daowen.com)

图3-5　转基因内皮细胞修饰血管内支架的制备及动物实验结果。（a）扫描电镜观察体外支架表面的细胞黏附和生长的情况；（b）转基因内皮细胞修饰支架植入1周、4周、12周硬组织切片甲苯胺蓝染色结果。［引自：唐朝君. 转基因内皮细胞修饰血管内支架的实验研究［D］. 重庆：重庆大学，2008.］
Figure 3-5　Preparation of transgenic endothelial cells modified intravascular scaffolds and animal experimental results. （a）Observation of cell adhesion and growth on the surface of the scaffold in vitro by scanning electron microscopy; （b）Toluidine blue staining results of hard tissue sections at 1, 4 and 12 weeks after implantation of transgene endothelial cell modified scaffolds. ［Adapted from: Tang C J. The Study of Endovascular Stent Seeded with Gene-transfection Endothelial Cells［D］. Chongqing: Chongqing University, 2008.］