3.3 血管损伤修复的细胞来源
研究表明，血管损伤后再内皮化修复不仅依赖于受损内膜邻近的成熟VECs的增殖和迁移，且与来源于骨髓的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的归巢、黏附和分化密切相关（图3-2）。1997年，Asahara等首次在Science杂志发表文章发现了EPCs。EPCs是VECs的前体细胞，又称为血管母细胞（angioblast），参与了血管生成，提示它在心血管疾病、缺血性疾病、血管再狭窄、创伤愈合等过程中的重要作用，其来源主要包括人脐静脉血、成人外周血和骨髓。体外培养的CD133+EPCs能成功诱导分化为血管内皮细胞。
目前已经报道的EPCs筛选方法主要有密度梯度离心法和免疫磁珠分选法。其主要标志物包括CD34+、VEGFR2+等。CD34+不仅在造血干细胞上表达，且在成熟内皮细胞上高表达。研究表明，CD34+细胞也具有EPCs的功能，骨髓和外周血来源的CD34+单核细胞也能在体内快速分化为EPCs样细胞而且有助于形成新生血管。2003年，Rehman等认为EPCs是转分化的CD14+单核细胞，在生成血管环境中呈现出VECs的表型特性。CD133/AC133作为一种分子量为120 kD的糖基化多肽的表面抗原，含有5个跨膜结构域。Gordon等指明CD133是一种生物学特性不清楚的抗原，在造血干细胞中表达，随着造血干细胞的分化成熟，CD133表达迅速下降，在成熟内皮细胞和单核细胞中不表达。因此，AC133目前作为一种非常有用的标记，用于分离造血和内皮祖细胞的分离。此外，VEGFR2+表达是鉴定具有产生内皮细胞能力细胞的一个重要的标准，这些细胞可以来源于造血干细胞，也可以来源于单核细胞。一种假设是VEGFR2+的表达是调节由其配体VEGF引起的信号传输的基本要求。然而，CD14+/VEGFR2+和CD34+/VEGFR2+一样，也显示出其他功能特征。VEGFR2+细胞表现更强的增殖、迁移和释放生长因子的能力。此外，EPCs在细胞膜上高表达CD31，而胞浆中Weibel-Palade小体的细胞器表达vWF。
采用Percoll梯度离心法和贴壁法分离大鼠骨髓中EPCs，通过免疫荧光、免疫细胞化学和流式细胞仪鉴定分离的EPCs，筛选EPCs特异性结合基质；并利用单微管吸吮技术研究EPCs对不同基质的黏附力，以及对基质浓度的依赖性；利用平行平板流动腔技术研究剪应力对EPCs结合基质能力。通过筛选抗再狭窄药物——苦参总碱，研究其对EPCs生物学功能的影响。研究结果表明：采用Percoll梯度离心法可分离到纯度较高VEGFR2+/CD34+/CD133+的EPCs（图3-3（a））；EPCs在抗体VEGFR2、CD34、CD133包被的基质上的黏附均呈浓度依赖性。EPCs对抗体CD133的黏附力最强，相比较VECs，EPCs对抗体CD133的特异性黏附显著，在VEC表面没有CD133抗原，CD133抗体对EPCs的更具有特异性 （图3-3（b））。EPCs在用CD133裱衬的流动腔上受到切应力作用，其保留率、增殖率都显著高于其他两种抗体裱衬；EPCs在用CD133裱衬的Chamber上受到切应力作用，NO表达量都显著增加，一定切应力作用可能会诱导EPCs向ECs定向分化。动物实验证明苦参总碱能有效地抑制内膜增生，适当浓度的苦参总碱对EPCs有促增殖作用，且不会减少EPCs对特异性基质的黏附能力；体外结果显示，CD133抗体对EPCs的捕获能力强于CD34抗体。
图3-2 EPCs和VECs参与支架植入后血管修复过程的示意图。（a）动脉粥样硬化斑块的形成； （b）支架的植入压迫斑块，维持血管畅通，但同时损伤血管，激活炎症反应和凝血系统；（c）支架植入早期，动员和活化VECs和EPCs；（d）植入后期，VECs增殖迁移和EPCs归巢黏附在支架表面进行内皮再生修复。修复过程可能产生两种结果；（e）修复不完全造成内皮化延迟，发生再狭窄；（f）修复完全，支架表面快速内皮化。［引自：Padfield G J, et al. Understanding the role of endothelial progenitor cells in percutaneous coronary intervention［J］. J Am Coll Cardiol, 2010, 55（15）: 1553-1565.］
Figure 3-2 Schematic diagram of the involvement of EPCs and VECs in the vascular repair process after stent implantation. （a）Atherosclerotic plaque formation. （b）The implantation of stents compresses plaques and maintains unblocked blood vessels, but at the same time damages blood vessels and activates inflammatory response and coagulation system. （c）At the early stage of stent implantation, VECs and EPCs were mobilized and activated. （d）At the later stage of implantation, the proliferation and migration of VECs and the homing of EPCs were attached to the surface of the scaffold for endothelial regeneration and repair. The repair process may produce two results; （e）Incomplete repair leads to delayed endothelialization and restenosis; （f）Complete repair and rapid endothelialization of the scaffold surface. ［Adapted from: Padfield G J, et al. Understanding the role of endothelial progenitor cells in percutaneous coronary intervention［J］. J Am Coll Cardiol, 2010, 55（15）: 1553-1565.］
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图3-3 EPCs的鉴定及其与基底黏附力测定。（a）免疫组化结合流式细胞仪测定Percoll梯度离心法和贴壁法分离大鼠骨髓中的EPCs，VEGFR2和CD133呈阳性表达。（b）采用微管吸吮系统观察EPCs被负压牵引离开其黏附基底的过程，进而计算得出其黏附力值。［引自：肖丽. 内皮祖细胞捕获支架特异性基质筛选及苦参总碱对细胞数量和功能的影响［D］. 重庆：重庆大学，2007.］
Figure 3-3 Identification of EPCs and their adhesion to the substrate. （a）Immunohistochemistry combined with flow cytometry was used to determine the EPCs in the bone marrow of rats separated by Percoll gradient centrifugation and adherent method, and the expression of VEGFR2 and CD133 was positive. （b）The microtubule sucking system was used to observe the process of EPCs being pulled away from the adhesive substrate by negative pressure, and then the adhesion force value was calculated. ［Adapted from: Xiao L. The Screening of Specific Substrates for Endothelial Progenitor Cell Capturing Stent and Effect of Sophorcarpidine on Number and Function of Cells［D］. Chongqing: Chongqing University, 2007.］
血管损伤造成内皮层脱落致血管内膜层裸露，伴随着血流动力学改变及炎症因子释放，激活并动员体内的多种细胞成分募集至损伤处完成修复。在这一过程中，先前观点普遍认为参与血管修复的内皮细胞主要来源于受损内膜邻近VECs的增殖和迁移。这一观点依赖于上皮细胞迁移修复表皮伤口的观察结果，并在早期Fishman的研究中得到证实：在一段血管腔内鼓入空气使血管内壁干燥，从而导致该部分血管内皮丢失。随后观察到裸露血管边缘的内皮细胞快速增殖，向中心无细胞区域迁移和生长。然而随着EPCs的发现，为血管修复的细胞来源和修复机制确立了新的观点。研究发现，血管移植后的新生内皮层主要来源于受体自身骨髓细胞，而非供体的血管。随后在心肌梗死后急性缺血、冠脉搭桥等动物模型中均得到证实，血管损伤将刺激血液循环中的EPCs大量增殖，定向分化为VECs，由此认为EPCs的动员、归巢和黏附是血管内皮层修复的主要过程，这一观点一度在血管损伤修复的研究中占据主导地位。研究者随后开发了CD34、CD133、VE-Cadherin抗体捕获EPCs支架、EPCs细胞治疗等方法，对支架植入段血管再内皮化具有明显的促进作用。然而，Tsuzaki等提出血管损伤后的再生内皮层没有发现骨髓来源的细胞。最近Hagensen等将Tie2-GFP、Tie2-LacZ转基因小鼠的血管移植入野生型小鼠损伤的颈动脉模型中，观察到新生的内皮层表达来自供体小鼠内皮细胞的绿色荧光和x-gel染色的β-半乳糖苷酶（β-gel，LacZ基因编码），且随着时间的推移由动脉手术接口处向中心部位迁移。由此明确指出：血管再内皮化主要来源于邻近VECs的迁移，而EPCs对内皮层的修复和再生没有贡献作用。而Douglas等在过表达环水解酶的GCH-Tg转基因小鼠模型（特异性地增强内皮细胞功能和NO含量）中植入DES，发现显著增强了内皮细胞覆盖率，进一步观察发现VECs的迁移和EPCs的归巢对支架段血管修复均有贡献。以上这些矛盾的研究结果再次引起了血管内皮修复细胞来源的讨论。Van der Heiden在随后的综述文章中推测，各研究中所观察到VECs和EPCs对再内皮化修复贡献作用的差异可能是采用了不同的动物病理模型，以及力学损伤模式和程度不同造成的。由此可见，血管损伤能够通过邻近VECs的迁移及循环血液中的EPCs的募集来完成修复，然而其各自确切的贡献和分子机制仍不明确。相对简单的血管损伤模型即有如此大的争议，而对于具有复杂几何构型的血管支架而言，在体内受到切应力、扩张对血管的不同损伤程度、支架表面理化性质等多种因素的影响，植入后的再内皮化进程将更为复杂。
值得注意的是，由于手术过程中施加球囊的压力具有一定的范围（8～10 atm）且患者血管直径存在个体差异，导致支架扩张对血管内膜和中膜层具有不同程度的损伤。Tahir等通过数值模拟计算支架植入深度（90、110、130 μm）对血管内弹力板（internal elastic lamina，IEL）的破坏程度及中层平滑肌细胞的损伤，来预测血管愈合后的内膜厚度。血管的损伤程度将导致支架在体内所处的力学微环境存在着较大的差异。支架在血管中不同的暴露方式和血流动力学的改变，都将决定着VECs迁移和EPCs的黏附速率，并最终决定其对再内皮化修复的贡献程度（图3-2（b））。此外，在血管损伤的尺度上，球囊的充盈和支架的扩张破坏了内皮层的完整性，导致内皮细胞大面积的剥蚀，同样对再内皮化进程有着重要的影响。支架植入后立刻处死动物，观察结果表明：球囊的充盈和支架扩张将会在植入的整个支架段血管造成了一个近乎完全裸露的内皮层，仅在支架边缘残留少量脱落的内皮细胞。因此，在整个网状支架血管段，均需要完成单层内皮的修复。
研究发现，VECs和流体切应力能够诱导EPCs向成熟的VECs分化。与VECs共培养2周后EPCs的成血管能力增强，内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）及vWF的mRNA水平显著增加。内皮细胞条件培养基诱导外周血分离的CD34+细胞40天，除KDR外，CD31、ICAM、Flt等标志物的表达水平与成熟VECs无显著差异。此外研究者还发现，层流切应力可上调EPCs的血管内皮生长因子受体（VEGFR，Flt-1/Flk-1）、VE-cadherin等内皮标志物和黏附分子的表达，并促使其在损伤处归巢参与血管修复。在猪颈动脉植入支架1天后发现，支架表面达到约30%的内皮覆盖率，且近心端的内皮覆盖率显著高于远心端。内皮细胞主要集中在支架的边缘，裸露的支架中心区域也有单个细胞黏附。通过分析以上结果提示我们：VECs对EPCs的归巢和分化具有诱导作用，而两者协同参与支架段血管的再内皮化修复受到了血流切应力的调控。
在应力损伤所致血管重塑过程中，凝血和炎症系统的激活均可能造成内皮化延迟。血管损伤导致血小板快速聚集，血小板和激活的内皮细胞分泌SDF-1和VEGF。同时，切应力的改变也会刺激内皮细胞释放大量的VEGF、PDGF、FGF、TGF-β等生长因子，活化包括PI3K、MAPKs等多条信号通路调控细胞骨架重排，动员EPCs归巢并向成熟的内皮细胞分化。虽然在体内复杂的力-化学微环境下，调控EPCs归巢参与血管修复的影响因素很多，但血液中VEGF浓度升高被认为是最关键的影响因素。VEGF通过与细胞膜表面VEGFR受体（Flk/Flt）结合，激活PI3K/AKT/eNOS信号通路。切应力上调eNOS并不完全依赖于细胞内Ca2+浓度的升高，AKT的活化介导了eNOS在Ser1177的磷酸化，而eNOS在Thr495位点的去磷酸化并在该区域结合钙调蛋白增加NO的生成。血液中NO浓度的升高将启动EPCs的动员、归巢和分化过程，参与血管修复。有研究证明，NO动员EPCs的过程是由基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的活化所介导的。在活化的MMP-9的作用下，KitL（kit-ligand）从膜结合分子转化为可溶性分子，即sKitL（soluble Kit-ligand），进入血液并与具有cKit受体的EPCs结合，促使其分化并调动至外周循环，到达作用部位。在eNOS基因敲除的小鼠内皮细胞内，MMP-9的表达和激活急剧减少，且新生血管形成时表现出明显的EPCs动员缺陷。VECs的迁移同样依赖于PI3K信号通路的激活。p110α亚型的PI3K通过磷酸化下游分子AKT，激活eNOS并释放NO。NO通过硝基化MMP酪氨酸残基，促进了MMP的胞外释放，降解细胞外基质从而促进了内皮细胞迁移。