6.3 Id1参与低震荡切应力引起的脂质吸收过程
在血管中，内皮细胞通过膜上感受器直接感应血流及其引起的各种应力如切应力、牵张力与周应力等。当血流动力学因素出现异常，如剪切力分布不均匀或者局部出现低震荡流时都会引起细胞内基因及蛋白异常表达从而影响内皮细胞正常的生物学功能。一旦内皮细胞功能发生紊乱，将导致细胞分泌促动脉粥样硬化相关因子，进而影响平滑肌细胞及炎症细胞功能发生变化，导致动脉粥样硬化病的发生发展。
Id1是调控细胞周期和分化的重要转录因子，前期报道TSP1是Id1蛋白的下游靶点，Id1蛋白抑制TSP1的表达；第1节中蛋白组鉴定结果显示OSS可促进TSP1蛋白表达，Id1蛋白可以抑制TSP1蛋白表达，参与RAP1信号通路过程；Chih-Wen Ni等对小鼠低震荡流区域血管内皮细胞的RNA进行微阵列芯片分析，发现低震荡流抑制Id1的表达，但Id1表达变化后会引起细胞发生什么样的功能障碍等并未做过多研究。基于以上结果，对小鼠颈动脉进行结扎手术后24 h进行血管内皮细胞Id1蛋白表达检测。表面（en face）染色结果发现结扎的左颈动血管内皮细胞中Id1蛋白的荧光强度明显下降，左颈动脉血管内皮中Id1蛋白阳性细胞大约比右颈动脉内皮细胞降低2.5倍，左颈动脉血管内皮中Id1蛋白表达明显低于右颈动脉。同时对结扎手术48 h后的血管进行en face检测，发现Id1蛋白的表达结果与24 h趋势一致。由于结扎后的左颈动脉血管内为低震荡切应力，而对侧假手术的右颈动脉血管内为层流切应力，由此确定，低震荡切应力可以抑制Id1蛋白的表达。对人脐静脉内皮细胞进行力学加载24 h，检测Id1蛋白的表达情况。Western blot结果显示层流切应力（12 dyn/cm2）可以促进Id1蛋白的表达，低震荡切应力（0.5±4 dyn/cm2）可以瞬间促进Id1蛋白的表达（图6-11）。
图6-11 人脐静脉内皮细胞中Id1蛋白的表达受到力学调控。（a）Western blot分析随着时间的增加，OSS及LSS下Id1蛋白的表达变化。（b）统计分析Id1蛋白的表达量，通过与Actin进行比较定量分析（n=3）。##p＜0.001表示与静态相比有显著差异。［引自：Zhang K, et al. A novel role of Id1 in regulating oscillatory shear stress-mediated lipid uptake in endothelial cells［J］. Ann Biomed Eng, 2018, 46（6）:849-863.］
Figure 6-11 Id1 protein expression was regulated by shear stress in HUVECs.（a）Western blot analysis of the level of Id1 treated with LSS and OSS over a time course of 24 h.（b）Quantitative analysis of Id1 expression, the expression was normalized to that of Actin（n=3）. ##p＜0.001 vs the static controls.［Adapted from: Zhang K, et al. A novel role of Id1 in regulating oscillatory shear stress-mediated lipid uptake in endothelial cells［J］. Ann Biomed Eng, 2018, 46（6）:849-863.］
构建Id1过表达的细胞并加载LSS（12 dyn/cm2）及OSS（0.5±4 dyn/cm2），验证Id1在OSS调控的脂质吸收过程中的作用。力学加载24 h后对细胞进行Dil-LDL处理，然后荧光观察分析细胞内Dil-LDL的吸收情况，发现无论是Flag-Id1细胞还是Flag-con细胞，OSS处理后细胞吸收的脂质明显高于LSS处理组（图6-12），说明OSS可以促进细胞内脂质的吸收，而OSS 处理下Flag-Id1细胞吸收的脂质显著低于Flag-con细胞，说明Id1参与了OSS对内皮细胞脂质吸收的调控过程，并且Id1过表达可以抑制OSS的作用（图6-12）。
为了确定在动脉粥样硬化疾病中Id1会与哪些蛋白发生作用从而参与OSS引起的血管功能变化，我们用IPA（ingenuity pathway analysis，IPA）软件进行了预测。相关上游调控因子结果如图6-13所示。这些预测的结果说明Id1在动脉粥样硬化疾病中起重要作用，可以受许多因子的调控，也可以调控许多因子的表达来影响动脉粥样硬化斑块的形成。还通过IPA分析了可能与Id1有作用的与脂质代谢相关的因子，结果如图6-14所示，Id1与LDLR、SREBP1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）等脂质相关因子都有关系。
(https://www.daowen.com)
图6-12 过表达Id1可以抑制OSS引起的内皮细胞脂质吸收过程。（a）对Id1过表达及对照组细胞分别进行力学加载后，荧光观察细胞内LDL的吸收情况。（b）Western blot分析对照（Flag-con）及过表达（Flag-Id1）细胞中Id1蛋白的表达量。（c）统计分析细胞吸收的荧光LDL的量（n=4）。*p＜0.05表示与对照组加载层流切应力（Flag-con LSS）相比有显著差异。#p＜0.05表示与过表达组加载层流切应力（Flag-Id1 LSS）相比有显著差异。@p＜0.05 表示与对照组加载低震荡切应力（Flag-con OSS）相比有显著差异。［引自：Zhang K, et al. A novel role of Id1 in regulating oscillatory shear stress-mediated lipid uptake in endothelial cells［J］. Ann Biomed Eng, 2018, 46（6）:849-863.］
Figure 6-12 Id1 overexpression can abolish OSS-mediated lipid uptake in ECs.（a）Immunofluorescence analysis of LDL uptake in Id1 overexpression（Flag-Id1）and control（Flag-con）ECs treated with shear stress.（b）Western blot was used to analysis the protein level of Id1 in Flag-Id1 and Flag-con ECs.（c）Quantitative analysis the mean fluorescence intensity of LDL in Flag-Id1 and Flag-con ECs（n=4）. *p＜0.05 vs the Flagcon LSS. #p＜0.05 vs Flag-Id1 LSS, @p＜0.05 vs Flag-con OSS.［Adapted from: Zhang K, et al. A novel role of Id1 in regulating oscillatory shear stress-mediated lipid uptake in endothelial cells［J］. Ann Biomed Eng, 2018, 46（6）:849-863.］
对小鼠颈动脉进行结扎手术进行en face染色发现OSS会抑制血管内皮细胞中Id1蛋白的表达；体外力学加载装置对血管内皮细胞进行LSS及OSS加载，结果发现：与静态相比，LSS（12 dyn/cm2）促进内皮细胞中Id1蛋白的表达，且随着时间的增加蛋白表达增加，12 h达到顶峰。与静态相比，OSS（0.5±4 dyn/cm2）在第6 h促进了Id1的表达，但随着加载时间的延长Id1蛋白表达被抑制，到第24 h Id1的表达低于静态水平。这说明与静态相比，不管是LSS还是OSS都可以调控Id1的表达，但是LSS和OSS对Id1的表达影响是不同的，LSS促进Id1蛋白的表达，而OSS抑制其表达。为了研究Id1蛋白是否参与了OSS对脂质吸收的调控过程构建了Id1过表达及对照细胞株。通过对这两种细胞加载层流切应力及低震荡切应力后检测Dil-LDL的吸收情况，结果发现OSS促进内皮细胞对脂质的吸收过程，但是Id1过表达后，OSS对内皮脂质吸收的促进作用则被部分抑制；通过IPA软件预测了动脉粥样硬化疾病中与Id1有相互调控作用因子，以及Id1可能调控的脂质相关蛋白，结果显示Id1调控了许多与AS相关的蛋白的表达，并且Id1与LDLR之间可能存在调控关系。
图6-13 IPA用于分析动脉粥样硬化中受Id1调控的分子。动脉粥样硬化疾病中，Id1可以调控许多与AS疾病密切相关的因子的表达，如NF-kB（核因子-kB）、CAV1（小窝蛋白）、MMP13（基质金属蛋白酶13）等。［引自：张康.Id1调控脂质吸收参与动脉粥样硬化斑块形成的力学生物学机制［D］. 重庆:重庆大学, 2018.］
Figure 6-13 IPA was used to analysis the molecules that regulated by Id1in atherosclerosis. In atherosclerotic diseases, Id1 can regulate the expression of many factors closely related to AS diseases, such nuclear factor-kB, CAV1, MMP13, etc.［Adapted from: Zhang K. The mechanogical mechanisms of Id1-regulated lipid uptake in atherosclerosis plaque formation［D］. Chongqing: Chongqing University, 2018.］
图6-14 脂质代谢相关分子与Id1的关系。IPA预测显示Id1与LDLR（低密度脂蛋白受体）、SREBP1（胆固醇调节元件结合蛋白-1）等脂质相关因子都有关系。［引自：张康.Id1调控脂质吸收参与动脉粥样硬化斑块形成的力学生物学机制［D］. 重庆:重庆大学, 2018.］
Figure 6-14 The relationship between Id1 and lipid metabolism related molecules. IPA prediction showed that Id1 was associated with LDLR（low density lipoprotein receptor）, SREBP1（cholesterol regulatory element binding protein-1）and other lipid related factors.［Adapted from: Zhang K. The mechanogical mechanisms of Id1-regulated lipid uptake in atherosclerosis plaque formation［D］. Chongqing: Chongqing University, 2018.］
对小鼠颈动脉进行结扎手术进行en face染色发现OSS会抑制血管内皮细胞中Id1蛋白的表达；体外力学加载装置对血管内皮细胞进行LSS及OSS加载。结果发现：与静态相比，LSS（12 dyn/cm2）促进内皮细胞中Id1蛋白的表达，且随着时间的增加蛋白表达增加，直到12 h达到顶峰。与静态相比，OSS（0.5±4 dyn/cm2）在第6 h促进了Id1的表达，但随着加载时间的延长Id1蛋白表达被抑制，到第24 h Id1的表达低于静态水平。这说明与静态相比，不管是LSS还是OSS都可以调控Id1的表达，但是LSS和OSS对Id1的表达影响是不同的，LSS促进Id1蛋白的表达，而OSS抑制其表达；为了研究Id1蛋白是否参与了OSS对脂质吸收的调控过程构建了Id1过表达及对照细胞株。通过对这两种细胞加载层流切应力及低震荡切应力后检测Dil-LDL的吸收情况，结果发现OSS促进内皮细胞对脂质的吸收过程，但是Id1过表达后，OSS对内皮脂质吸收的促进作用则被部分抑制；通过IPA软件预测了动脉粥样硬化疾病中与Id1有相互调控作用因子，以及Id1可能调控的脂质相关蛋白，结果显示Id1调控了许多与AS相关的蛋白的表达，并且Id1与LDLR之间可能存在调控关系。