6.2 低震荡切应力引起脂质堆积促进AS斑块形成
血管内脂质沉积受多种因素调控。一方面，Karino等提出的动脉粥样硬化脂质浓度极化假说认为血液中的脂质存在浓度极化现象，通过斑马鱼实验及数值模拟证实在血流流场紊乱的低震荡流区域，壁面脂质浓度会高于其他层流区域，这更容易促进脂质在这些区域渗透及沉积；另一方面，低震荡流会影响内皮层功能，促进内皮细胞通透性，更加剧脂质的沉积，并且低震荡切应力刺激内皮细胞后，会调控内皮细胞中脂质相关蛋白如胆固醇调节元件结合蛋白-1（sterol-regulatory element binding protein-1，SREBP1）的表达，这些分子的表达又会加速细胞对的脂质吸收。但是目前关于低震荡切应力调控脂质沉积进而促进斑块发生发展的相关机制并没有完全阐述清楚。
基于前人的研究结果，利用小鼠低震荡切应力模型以及体外力学加载装置，研究OSS对脂质沉积及斑块形成的影响。
将小鼠分成两组：低震荡切应力组和对照组。低震荡切应力组中，小鼠左颈动脉分支进行结扎而对侧的右颈动脉只进行假手术处理；对照组中，小鼠左颈及右颈动脉都只进行假手术处理。分别取两组小鼠血液，进行总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、LDL以及HDL的含量检测，结果如图6-6所示，低震荡切应力组和对照组中，手术前后血液中的TG和HDL的含量随着时间的增加没有发生明显变化。TC及LDL的含量结果显示，手术后低震荡切应力组和对照组都有上升趋势，但随着时间的增加，这种上升趋势又开始下降。第2周、4周及6周的TC及LDL与手术前基本上没有差异，低震荡切应力组和对照组之间也没有差异。有差异的时间点主要集中在手术后24 h的样本，LDL的变化趋势与TC类似，细微的差别在于对照组手术后24 h血液中LDL的含量显著高于手术前。我们分析TC以及LDL的这种差异可能是由于结扎手术造成的损伤较假手术更大而引起。
图6-6 手术前后对照组及低震荡切应力组血液中TC、TG、LDL、HDL含量检测（n=5）。**p＜0.001表示与低震荡切应力组手术前相比有极显著差异，#p＜0.05、##p＜0.001表示与对照组手术后24 h相比有显著/极显著差异，@p＜0.05表示与对照组手术前相比有显著差异。No ligation指对照组，Partial ligation 指低震荡切应力组。［引自：张康.Id1调控脂质吸收参与动脉粥样硬化斑块形成的力学生物学机制［D］. 重庆:重庆大学, 2018.］
Figure 6-6 Serum lipid profile analysis before and after surgery in the control groups and OSS groups（total cholesterol, TC; triglyceride, TG; lowdensitylipoprotein, LDL; high-densitylipoprotein, HDL）（n=5）.**p＜0.001 vs the OSS groups before surgery, #p＜0.05 and ##p＜0.001 vs the control groups 24 hours after surgery, @p＜0.05 vs the control groups before surgery. No ligation is the control groups. Partial ligation is the OSS groups.（Adapted from: Zhang K. The mechanogical mechanisms of Id1-regulated lipid uptake in atherosclerosis plaque formation［D］. Chongqing: Chongqing University, 2018.］
对左颈动脉低震荡切应力区域的血管、对侧右颈动脉层流切应力区域的血管以及对照组左颈及右颈总动脉血管进行石蜡切片及HE染色，发现低震荡切应力组的左颈总动脉从第2周开始血管内膜出现增厚，随着结扎时间的增加血管内膜增生越来越明显，并且出现胆固醇结晶及脂质坏死核，到第10周斑块几乎堵塞整个血管。而对侧的右颈动脉以及对照组血管管腔没有明显的内膜增生及斑块形成（图6-7（a）和（b）），说明低震荡切应力可以促进内膜增生及斑块形成。
大体油红染色结果显示（图6-8），从第4周开始低震荡切应力组小鼠的左颈总动脉内脂质逐渐开始积累，此后，随着时间的增加（6—10周），脂质沉积逐渐增多，尤其是到第10周，脂质几乎遍布整个管腔。而对侧的右颈总动脉及对照组小鼠的左及右颈总动脉血管内一直没有出现明显的脂质沉积。冰冻切片CD31及BODIPY荧光染色结果如图6-9所示，低震荡切应力组小鼠左颈总动脉血管内膜中脂质吸收明显增多，而对侧右颈总动脉及对照组小鼠左颈及右颈动脉内膜中的脂质非常少。对内皮细胞脂质吸收情况进行统计后发现，低震荡切应力组中，左颈总动脉内皮细胞吸收的脂质明显高于对侧右颈动脉及对照组左颈及右颈动脉，并且随着结扎时间的延长，脂质的积累也越来越多。以上结果表明OSS可以促进血管内皮细胞吸收更多脂质。
图6-7 OSS促进动脉粥样硬化斑块形成。（a）HE染色分析低震荡切应力组和对照组手术后（2，4，6，8，10 weeks）的左右颈动脉斑块形成情况。（b）定量分析各个血管的内膜和中膜比（n=4）。*p＜0.05 和**p＜0.001表示与对照组的LCA相比有显著/极显著差异。#p＜0.05 and ##p＜0.001 表示与低震荡切应力组RCA相比有显著差异。No ligation指对照组，Partial ligation 指低震荡切应力组。［引自：张康.Id1调控脂质吸收参与动脉粥样硬化斑块形成的力学生物学机制［D］. 重庆:重庆大学, 2018.］
Figure 6-7 OSS induced plaque formation.（a）HE staining was used to analyse the plaque formation in left and right carotid arteries of OSS groups and control groups after surgery（2, 4, 6, 8, 10 weeks）.（b）Quantitative analysis the intima/media ratio（n=4）. *p＜0.05 and **p＜0.001 vs the LCA of the control groups. #p＜0.05 and ##p＜0.001 vs the RCA of the OSS groups. No ligation is the control groups. Partial ligation is the OSS groups.［Adapted from: Zhang K. The mechanogical mechanisms of Id1-regulated lipid uptake in atherosclerosis plaque formation［D］. Chongqing: Chongqing University, 2018.］(https://www.daowen.com)
图6-8 OSS促进脂质在血管内沉积。（a）油红染色检测对照组及低震荡切应力组手术后RCA和LCA内的脂质堆积情况（2，4，6，8，10 weeks）。（b）统计分析油红染色区域（n=4）。*p＜0.05 和**p＜0.001表示与对照组的LCA相比有显著/极显著差异。 #p＜0.05 and ##p＜0.001 表示与低震荡切应力组的RCA相比有显著差异。No ligation指对照组，Partial ligation 指低震荡切应力组。［引自：张康.Id1调控脂质吸收参与动脉粥样硬化斑块形成的力学生物学机制［D］. 重庆:重庆大学, 2018.］
Figure 6-8 OSS promoted lipid accumulation in vessels.（a）Oil Red O staining analysis of time-course lipid accumulation in left and right carotid arteries of the control groups and OSS groups（2, 4, 6, 8, 10 weeks）.（b）Quantitative analysis the Oil red O staining areas（n=4）. *p＜0.05 and **p＜0.001 vs the LCA of control groups. #p＜0.05 and ##p＜0.001 vs the contralateral RCA of the OSS groups. No ligation is the control groups. Partial ligation is the OSS groups.［Adapted from: Zhang K. The mechanogical mechanisms of Id1-regulated lipid uptake in atherosclerosis plaque formation［D］. Chongqing: Chongqing University, 2018.］
对HUVECs进行体外静态（static）、层流切应力（12 dyn/cm2）及低震荡切应力（0.5±4 dyn/cm2）加载并用Dil-LDL处理，通过荧光显微镜观察细胞脂质吸收情况，结果如图6-10所示，与静态及LSS相比，OSS可以促进内皮细胞吸收更多低密度脂蛋白。体外加载实验再次证明OSS可以促进内皮细胞对脂质的吸收。
前期研究发现低震荡流可通过促进内皮炎症反应及EC增殖，进而加速斑块的形成。将内皮细胞与BCECF-AM标记的THP-1细胞与内皮细胞共培养，发现OSS处理及随后的脂质吸收显著促进内皮细胞对THP-1细胞的黏附。Ki67免疫荧光染色检测ECs增殖情况，结果显示OSS处理及随后的脂质吸收促进EC增殖。
图6-9 OSS促进在体血管内皮细胞的脂质吸收。（a）免疫荧光检测对照组及低震荡切应力组手术后，随着时间的增加，血管内皮细胞脂质吸收情况（2，4，6，8，10 weeks）。L表示血管管腔。白色箭头指血管内皮细胞。（b）统计分析BODIPY，DAPI和CD31三阳性细胞与DAPI，CD31双阳性细胞的百分比（n=4）。*p＜0.05 和 **p＜0.001表示与对照组的LCA相比有显著差异。#p＜0.05 and ##p＜0.001 表示与低震荡切应力组对侧的RCA相比有显著差异。No ligation指对照组，Partial ligation 指低震荡切应力组。［引自：Zhang K, et al. A novel role of Id1 in regulating oscillatory shear stress-mediated lipid uptake in endothelial cells［J］. Ann Biomed Eng, 2018, 46（6）:849-863.］
Figure 6-9 OSS promoted endothelial cells lipid uptake in vivo.（a）Immunofluorescence staining analysis of time-course lipid accumulation in left and right carotid arteries of the control groups and OSS groups（2, 4, 6, 8, 10 weeks）; L, lumen. White arrow, endothelial cells.（b）Quantitative analysis of the percentage of BODIPY, DAPI and CD31 triple positive cells relative to DAPI and CD31 double positive cells in intima（n=4）. *p＜0.05 and **p＜0.001 vs the LCA of the control groups. #p＜0.05 and ##p＜0.001 vs the RCA of the OSS groups. No ligation is the control groups. Partial ligation is the OSS groups.［Adapted from: Zhang K, et al. A novel role of Id1 in regulating oscillatory shear stress-mediated lipid uptake in endothelial cells［J］. Ann Biomed Eng, 2018, 46（6）:849-863. ］
本节通过构建小鼠颈动脉结扎模型及体外力学加载实验来研究切应力在动脉粥样硬化斑块形成中的作用。对手术前及手术后24 h、2 周、4 周、6 周的血浆脂蛋白进行检测，发现低震荡切应力对血浆脂蛋白的含量没有显著影响；HE染色及大体油红染色发现OSS区域更易形成斑块并且脂质沉积随着时间的增加而加重。冰冻切片免疫荧光染色发现，OSS会促进血管内皮细胞吸收更多脂质。通过体外力学加载装置对内皮细胞进行LSS及OSS加载证实OSS可以促进内皮细胞吸收脂质；而THP-1与HUVECs的黏附实验以及Ki67免疫荧光染色实验发现OSS处理及随后的LDL吸收可以促进内皮细胞的增殖及与炎症细胞的黏附。
图6-10 OSS促进内皮细胞脂质吸收。（a）荧光分析力学处理后的内皮细胞脂质吸收情况。（b）统计分析荧光强度（n=4）。@p＜0.05 和 @@p＜0.001表示与静态相比有显著/极显著差异。 &&p＜0.001表示与LSS相比有显著差异。［引自：Zhang K, et al. A novel role of Id1 in regulating oscillatory shear stress-mediated lipid uptake in endothelial cells［J］. Ann Biomed Eng, 2018, 46（6）:849-863.］
Figure 6-10 OSS promoted endothelial cells lipid uptake in vitro.（a）Immunofluorescence analysis of LDL uptake in ECs treated with static, LSS and OSS for 24 h.（b）Quantitative analysis the mean fluorescence intensity of LDL（n=4）. @p＜0.05 and @@p＜0.001 vs the static controls. &&p＜0.001 vs the LSS controls.［Adapted from: Zhang K, et al. A novel role of Id1 in regulating oscillatory shear stress-mediated lipid uptake in endothelial cells［J］. Ann Biomed Eng, 2018, 46（6）:849-863.］