4.1.2 血流动力学调节血管发育的分子机制
近年来有大量围绕力学对血管发育的研究开展，从基因到生物整体水平不同的层次上对血管发育—力学关系进行了探索，重点研究领域为力学是如何导致血管发育异常的，以及其相关的力学信号通路和调节途径。前期的研究发现，不管是通过tnnt2a-MO处理导致的没有血流的斑马鱼还是化学抑制剂处理减慢血流的斑马鱼中，斑马鱼的低氧诱导因子hif-1α和hif-2α表达与对照组没有显著性差别，缺氧没有参与血流缺失引起的CVP发育畸形过程。研究发现没有血流和血流减慢的斑马鱼在尾部有明显的细胞凋亡情况，但是进一步的研究发现注射p53 MO只能够对flk1的表达进行回救，且对斑马鱼CVP的血管生成是不能够进行回救，说明细胞凋亡途径不参与血流动力学调节CVP血管生成过程。
（1）ERK5-klf2a信号参与血流动力学调节的血管生成过程
Klf家族是最近广为研究和报道的一类参与血管系统活动的锌指结构转录因子。锌指Kruppel样转录因子（Kruppel-like factor）是在羧基末端含有共同的3个紧密相连的乙炔样锌指结构的一类转录因子的统称，该家族中klf2、klf4、klf5、klf6是颇受关注的与血管发育和血管疾病过程相关的几种因子。最早发现klf2（KLF2/LKLF）主要是在肺里面表达的，因此其全称为肺Kruppel样转录因子。一系列研究证明klf2是血管血液循环系统中血流动力学最关键的力学响应因子。研究表明在鼠的微血管内皮细胞中血流切应力诱导klf2转录因子表达，并通过转染荧光基因到klf2基因5′旁侧区，证明切应力诱导klf2表达的基因响应区域为转录起始位点-157至-95 bp处。血流可通过ERK5/MEF2信号通路诱导的AMPK活性，调节klf2的表达。klf2是作为血管内皮细胞一个很重要的转录调节器，klf2通过改变如eNOS、VEGFR2以及TNF-α等因子的表达水平，经由JNK、MAPK等信号通路，参与调节与内皮细胞迁移、血管舒张功能、炎症、细胞内稳态以及应力纤维相关的细胞形态改变的相关生理过程。在动脉特殊区域血流动力学诱导产生的klf2具有抗动脉粥样硬化的作用。
大量研究显示klf2参与细胞不同的生理病理过程。而近来发现klf2作为血流动力学的响应因子在血管发育特别是血管生成过程中发挥重要作用，能调控多种酶和转录因子的表达调节血管发育。有研究证明klf2a作为血流动力学的响应因子通过mir-126信号通路与VEGF通路协同作用调节血管生成过程。血管生成过程中过表达klf2可以有效地抑制KDR和VEGFR2的表达，通过VEGFR2/KDR信号通路调控血管生成过程。klf2与ETS家族蛋白ERG协同作用激活血管内皮flk1的表达调节血管发育。同时在心血管系统发育早期红细胞生成过程中klf2扮演很重要的角色，调节人和鼠胚胎样珠蛋白基因的表达。最近研究发现，注射tnnt2a-MO导致明显的klf2a表达下降，暗示了血流动力学调控klf2a的表达（图4-3（e）），且单细胞时期注射klf2a-MO到胚胎不仅导致flk1表达下调（图4-3（d））并且导致明显的CVP缺陷（图4-3（f）—（h））。以上研究表明klf2a在斑马鱼CVP血管新生中扮演了非常关键的作用。
图4-3 血流介导的ERK5通过Klf2a调节斑马鱼的CVP血管生成过程。（a）在36 hpf，通过荧光显微镜评估BIX02189和klf2a mRNA对斑马鱼CVP的形成。从左前侧看，背侧向上。CVP是用黄色箭头标记。比例尺100 μm。（b）从（a）图获得的CVP区域的更高放大倍率。VV用红色标记箭头。比例尺50 μm。（c）用DMSO（n=56），BIX02189（n=50），BIX02189 + klf2a mRNA（n=47）处理过的胚胎。BIX02189处理过的胚胎的CVP缺陷可以通过斑马鱼血管生成中的klf2a mRNA回救（平均值±SD，显著性与对照性相比，ANOVA，***p ＜0.001）。（d）尾部区域在36 hpf flk1全胚原位杂交。左图显示了对照（DMSO），BIX02189和BIX02189 + klf2a mRNA。CVP带有黄色箭头标记。右图显示了用对照MO，klf2a MO处理的胚胎。CVP用黑色箭头标记。从左前侧看，背侧向上。比例尺，100 μm。（e）胚胎注射tnnt2a-MO后，在36 hpf处CVP区和周围组织中的klf2a全胚原位杂交。左图显示用对照MO，tnnt2a-MO处理的胚胎。右图显示了用对照（DMSO）BIX02189处理的胚胎。侧视图，左前，背侧向上。比例尺100 μm。（f）flk1:GFP转基因胚胎的荧光显微镜图像36 dpf。从左前侧看，背侧向上。CVP带有黄色箭头标记。比例尺100 μm。（g）图是（f）的放大图，VV中CVP区域的用红色箭头标记。比例尺50 μm。（h）含有CVP的体节所占百分比。对照MO（n=58），klf2a-MO（n=52）。（平均值±SD，t检 验，***p＜0.001）。［引 自：Xie X, et al. Blood flow regulates zebrafish caudal vein plexus angiogenesis by ERK5-klf2a-nos2b signaling［J］. Curr Mol Med, 2018, 18（1）: 3-14.］
Figure 4-3 Blood flow-mediated ERK5 regulates zebrafish CVP angiogenesis through Klf2a.（a）At 36 hpf, the formation of zebrafish CVP by BIX02189 and klf2a mRNA was evaluated by fluorescence microscopy. Seen from the front left side, the back side is upward. CVP is marked with a yellow arrow. The scale bar is 100 μm.（b）The higher magnification of the CVP area obtained from A. VV is marked with a red arrow. The scale bar is 50 μm.（c）Embryos treated with DMSO（n=56）, BIX02189（n=50）, BIX02189 + klf2a mRNA（n=47）. CVP deficiency in embryos treated with BIX02189 can be rescued by klf2a mRNA in zebrafish angiogenesis（mean ± SD, significance compared with control, ANOVA, ***p ＜0.001）.（d）In situ hybridization of the tail region at 36hpf flk1 whole embryo. The left panel shows the control（DMSO）, BIX02189 and BIX02189 + klf2a mRNA. CVP is marked with a yellow arrow. The right image shows embryos treated with control MO, klf2a-MO. CVP is marked with a black arrow. Seen from the front left side, the back side is upward. Scale bar, 100μm.（e）After the embryo is injected with tnnt2a-MO, in situ hybridization of klf2a whole embryos in the CVP region and surrounding tissues at 36 hpf. The left image shows embryos treated with control MO, tnnt2a MO. The right panel shows embryos treated with control（DMSO）BIX02189. Side view, front left, back side up. The scale bar is 100 μm.（f）Fluorescence microscope image of flk1:GFP transgenic embryo at 36 dpf. Seen from the front left side, the back side is upward. CVP is marked with a yellow arrow. The scale bar is 100μm.（g）An enlarged view of Figure（f）. The CVP area in the VV is marked with a red arrow. The scale bar is 50μm.（h）The percentage of body segments containing CVP. Control MO（n=58）, klf2a-MO（n=52）.（Mean ± SD, t test, ***p＜0.001）.［Adapted from: Xie X, et al. Blood flow regulates zebrafish caudal vein plexus angiogenesis by ERK5-klf2anos2b signaling［J］. Curr Mol Med, 2018, 18（1）: 3-14.］
胞外信号调控激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）是一种重要的信号转导蛋白，它正常定位于胞浆，当激活后转位细胞核，调节转录因子活性，产生细胞效应。ERK信号通路是最重要的信号转导途径之一，它能够调节细胞的增殖、分化等多种重要生化反应。最新研究表明血流动力学引起内皮细胞形态改变及骨架重排，klf2的表达随细胞骨架微管状态的改变发生变化，并受到ERK5信号通路的影响。也有研究指出，血流切应力诱导的细胞骨架中间丝、波形蛋白以及结蛋白基因表达的变化会引起动脉扩张和重塑，细胞骨架微管网络结构变化会影响eNOS基因表达。
最新研究显示ERK5抑制剂BIX02189处理斑马鱼胚胎不仅导致CVP部位的flk1表达下调（图4-3（d））并且导致明显的CVP缺陷（图4-3（a）—（b））。进一步的研究发现过表达klf2a mRNA可以拯救ERK5抑制剂BIX02189导致的斑马鱼CVP血管新生的缺陷（图4-3（a）—（b）），以上研究表明ERK5是通过调控klf2a参与斑马鱼CVP血管新生。
（2）eNOS参与血流动力学调节的血管生成过程
在内皮细胞功能正常的情况下，维持血管系统正常生理运转的NO合成主要是由内皮一氧化氮合酶（eNOS）指导完成的。血流切应力不仅影响eNOS的胞内分布，并且可以通过调节VEGFR2、c-Src酪氨酸激酶、AMP蛋白激酶等细胞因子，调控eNOS表达。细胞骨架通过G-actin和F-actin调节eNOS的表达，这一过程具有细胞生长和密度依赖性。内皮一氧化氮激酶的调节基本都是在转录水平进行的，但是还是有各种各样的修饰和转录后调节，如通过细胞内定位和蛋白相互作用，对其进行的酰基化作用和磷酸化作用。eNOS作为血管血液循环系统中血流动力学关键的力学响应因子，其不仅具有抗动脉粥样硬化作用，并且参与血管发育过程。
动脉生成过程中eNOS的表达模式与旁系血管的发育紧密相关，提示eNOS在动脉生成的过程中扮演很重要的角色。研究发现在eNOS基因敲除的小鼠中，自然发育和疾病模型中小鼠动脉血管都出现疏松并且透明化的情况，并且证明在疾病模型中这一过程是通过调节细胞增殖情况来实现的。eNOS不仅调节鼠卵黄囊血管发生，而且对高葡萄糖引起的血管病变有回救作用。
NO调节斑马鱼心血管系统早期发育，而且在个体发育过程中的血管系统维持扮演很重要的角色。采用数字运动分析录像技术研究NO和肾上腺素对斑马鱼血管发育中动脉和静脉的影响，证明在斑马鱼幼鱼组织中的血管管腔发育受到NO和肾上腺素等内皮细胞分泌物的调节。目前在鱼类中还没有找到和eNOS同源的基因，但是研究发现在斑马鱼中的NOS2b含有一个与哺乳动物eNOS共同的特殊功能区域：N端十四酰化序列。在哺乳动物中，eNOS上面的N端十四酰化和十六酰化序列的靶点位置是在细胞质膜的微小区域（一般被认作为细胞质膜微囊），细胞质膜微囊可以促进与其他细胞蛋白质和脂质的相互作用以启动信号转导途径。不仅斑马鱼中的NOS2b与哺乳动物eNOS含有共同的功能区域，另有研究发现他们在心脏区域的表达和对脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）的应激反应都是一样的。最近的研究发现，注射NOS2b-MO不仅导致flk1表达下调（图4-4（b））并且引起明显的CVP缺陷（图4-4（a），（c）），表明斑马鱼NOS2b参与了血流动力学调节的血管发育过程。
近年来研究显示klf2可以调节eNOS表达，说明klf2作为eNOS响应血流切应力的重要分子开关。研究证明他汀类药物（抑制素）通过klf2起到抗动脉粥样硬化和抗血栓作用，而这个过程是通过klf2调节内皮一氧化氮激酶和血栓调节蛋白活性来实现的。研究发现持续的切应力比他汀类药物（抑制素）更能维持持续的klf2表达，从而维持eNOS和血栓调节蛋白表达，进而能更好起到抗动脉粥样硬化和抗血栓作用。最近的研究发现，过表达NOS2b能够拯救注射tnnt2a-MO或者注射klf2a-MO导致的CVP血管新生缺陷（图4-4（a），（c）），NOS2b 位于klf2a下游调控斑马鱼CVP血管新生。
图4-4 klf2a通过NOS2b调控斑马鱼CVP血管生成。（a）胚胎激光共聚焦图像，36 hpf。从左前侧看，背侧向上。CVP用黄色箭头标记。比例尺100 μm。下图显示CVP区域的放大图。VV用红色箭头标记。比例尺50 μm。（b）36 hpf 的flk1的原位杂交图。从左前侧看，背侧向上。CVP用黑色箭头标记。比例尺，100 μm。（c）含有CVP体节所占百分比：对照MO（n=67），tnnt2a-MO（n=61），klf2a-MO（n=54），NOS2b-MO（n=42），tnnt2a MO + NOS2b mRNA（n=46），klf2a-MO + NOS2b mRNA（n=39）。（平均值±SD，显著相对于对照，ANOVA，***p＜0.001）。（d）信号通路调节图。［引自：Xie X, et al. Blood flow regulates zebrafish caudal vein plexus angiogenesis by ERK5-klf2a-nos2b signaling［J］. Curr Mol Med, 2018, 18（1）: 3-14.］
Figure 4-4 Klf2a regulates zebrafish CVP angiogenesis through NOS2b.（a）Confocal laser image of embryo, 36hpf. Seen from the front left side, the back side is upward. CVP is marked with a yellow arrow. The scale bar is 100 μm. The image below shows an enlarged view of the CVP area. VV is marked with a red arrow. The scale bar is 50 μm.（b）In situ hybridization map of flk1 at 36 hpf. Seen from the front left side, the back side is upward. CVP is marked with a black arrow. Scale bar, 100μm.（c）Percentage of somites containing CVP: control MO（n=67）, tnnt2a-MO（n=61）, klf2a-MO（n=54）, NOS2b-MO（n=42）, tnnt2a-MO + NOS2b mRNA（n=46）, klf2a MO + NOS2b mRNA（n=39）.（Mean±SD, significant relative to control, ANOVA, ***p＜0.001）.（d）Signal path regulation diagram.［Adapted from: Xie X, et al. Blood flow regulates zebrafish caudal vein plexus angiogenesis by ERK5-klf2anos2b signaling［J］. Curr Mol Med, 2018, 18（1）: 3-14.］(https://www.daowen.com)
（3）klf6a-tagln2参与血流动力学调节的血管生成过程
在斑马鱼胚胎发育过程中，CVP的腹侧毛细血管发育成尾部静脉血管（CV）。然而，这一发展过程的细节及其潜在机制仍不清楚。为了解决这个问题，我们使用共聚焦显微镜观察受精后32 hpf至72 hpf的野生型（WT）Tg（flk1:EGFP）转基因胚胎中的CV发育如图4-5（a）所示。我们发现CV形成是一个动态过程，CV是由斑马鱼胚胎中CVP的腹侧毛细血管重塑的。如图4-5（b）所示，CVP的腹侧毛细血管水平迁移并在32 hpf 处相互连接。在36 hpf时，它们发育成具有血管袢的管腔血管。由于血液流动，这些管腔血管经历了戏剧性的重塑过程，并在60 hpf时发展为CV。有趣的是，血管袢（白色箭头）的数量与CV形成之间存在负相关。如图4-5（c）所示，随着血管环的数量从36 hpf时的8.47个减少到54 hpf时的2个，CVP的腹侧毛细血管最终重新排列以在60 hpf时建立称为CV的均匀血管。共同重塑CVP的腹侧毛细血管以建立CV伴随着斑马鱼胚胎中血管袢的减少。
图4-5 斑马鱼尾静脉形成涉及血管重塑。（a）斑马鱼胚胎尾部脉管系统的共聚焦图像。箭头指向没有连接的腹侧 CVP 毛细血管。箭头指向血管环。比例尺：50 μm。（b）CV 中血管环数量的量化：36 hpf，n=17个胚胎； 48 hpf，n=23个胚胎；54 hpf，n=19个胚胎；60 hpf，n=22个胚胎；72 hpf，n=13个胚胎。（c）CV中血管直径的量化。（d）CV中血流速度的量化。［引自：王贵学. Flow-dependent vessel pruning governs zebrafish CV formation by klf6a/tagln2 axis［C］. 第七届中美生物医学工程与生物力学研讨会大会报告. 重庆, 2019.］
Figure 4-5 The zebrafish caudal vein formation involves vascular remodeling.（a）Confocal images of the caudal vasculature of zebrafish embryos.（b）Quantification of the number of vascular loops in the CV: 36 hpf, n=17 embryos; 48 hpf, n=23 embryos; 54 hpf, n=19 embryos; 60 hpf, n=22 embryos; 72 hpf, n=13 embryos.（c）Quantification of the diameters of the CV.（d）Quantification of the blood flow velocities in the CV.［Adapted from: Guixue Wang. Flow-dependent vessel pruning governs zebrafish CV formation by klf6a/tagln2 axis［C］. The 7th Sino-American Workshop on Biomedical Engineering and Biomechanics. Chongqing, 2019.］
Klf样转录因子家族在调节血流动力学力介导的心血管稳态中起着重要作用。在斑马鱼的24个Klf家族基因中，只有klf6a在36 hpf的斑马鱼胚胎的CVP中通过整体原位杂交（WISH）富集。因此，我们推测klf6a可能参与CV斑马鱼胚胎的修剪。为了确定klf6a是否对血流有反应，我们进行了一个流动室实验，在该实验中，我们将人脐静脉ECs（HUVECs）暴露于静态（0 dyn/cm2）或生理剪切应力（12 dyn/cm2）12 h。我们的研究结果表明，流动剪切应力（FSS）在体外HUVEC中在 mRNA 和蛋白质水平诱导KLF6表达。此外，WISH显示，由于用三卡因和tnnt2a-MO治疗导致血流速度降低，在36 hpf时显著破坏了CVP区域的klf6a mRNA水平。这些结果表明klf6a对体外和体内的血液动力学力都有反应。为了进一步验证klf6a是否在斑马鱼胚胎的CV中表达，我们使用CRISPR/Cas9技术生成了KI（klf6a-HA-P2A-gal4）;Tg（UAS:EGFP）KI 鱼。HA P2A-gal4序列在终止密码子之前插入klf6a基因的最后一个外显子并融合到klf6a-HA-P2A-gal4中，如图4-6（a）所示。然后将成年F0 KI（klf6a-HA-P2A gal4）系与Tg（UAS:EGFP）鱼杂交。我们通过使用目标位点特异性和供体特异性引物以及随后的测序分析对其基因组DNA的PCR分析鉴定了后代。与我们的WISH结果和其他报告中斑马鱼中klf6a的表达一致，KI（klf6a-HA-P2A-gal4）胚胎在CV的脉管系统中显示出弱但清晰的EGFP表达（图4-6（b））。这些结果表明klf6a在斑马鱼胚胎的CV中表达并且对体外和斑马鱼胚胎中的血流动力学有反应。
为了证实klf6a在斑马鱼CV修剪中的作用，我们在单细胞阶段将klf6a-MO注射到Tg（flk1:EGFP;gata1a:dsRed）胚胎中。我们观察到klf6a的敲低在72 hpf时显著增加了CV中血管环的数量（平均环数：对照=0.666 7，klf6a-MO=1.703 7），尽管胚胎显示出正常的形态。为了进一步证实klf6a对斑马鱼胚胎CV修剪的影响，我们通过CRISPR/Cas9生成了klf6a 的斑马鱼突变体，其中从外显子2 中删除了7bp DNA片段。与对照组相比，klf6a的缺失在72 hpf时增加了CV中的血管环数（平均环数：sibling=0.434 78，klf6-/-=1.923 08；图4-6（c）和4-6（d））。这些结果表明klf6a是斑马鱼胚胎CV修剪所必需的。
图4-6 转录因子klf6a调节斑马鱼的CV修剪。（a）KI（klf6a-HA-P2A-gal4）鱼的生成。（b）KI（klf6a-HA-P2A-gal4）鱼的表达模式。箭头表示klf6a在脉管系统中的位置。（c）klf6a在斑马鱼胚胎CV修剪中的作用。方框显示了左图放大图像。箭头表示未修剪的血管。比例尺：50 μm。（d）sibling和klf6a-/-血管环的量化：sibling，n=23个胚胎；klf6a-/-，n=13个胚胎。p＜0.001。学生的未配对双尾t检验。［引自：王贵学. Flow-dependent vessel pruning governs zebrafish CV formation by klf6a/tagln2 axis［C］. 第七届中美生物医学工程与生物力学研讨会大会报告. 重庆, 2019.］
Figure 4-6 Transcription factor klf6a regulates CV pruning in zebrafish.（a）Generation of KI（klf6a -HA-P2A-gal4）fish.（b）Expression pattern of KI（klf6a-HA-P2Agal4）fish. Arrowheads indicate the location of klf6a at the vasculature.（c）Role of klf6a in CV pruning in zebrafish embryos. Boxes show enlarged images of the CV. The arrowhead indicates the unpruned vessel. Scale bar: 50 μm.（d）Quantification of vascular loops in the sibling and klf6a-/-: sibling, n= 23 embryos; klf6a-/-, n=13 embryos. p＜0.001. Student’s unpaired two-tailed t test.［Adapted from: Guixue Wang. Flow-dependent vessel pruning governs zebrafish CV formation by klf6a/tagln2 axis［C］. The 7th Sino-American Workshop on Biomedical Engineering and Biomechanics. Chongqing, 2019.］
转录因子klf6a对肌动蛋白细胞骨架排列的影响增加了细胞骨架相关基因可能参与klf6a介导的斑马鱼胚胎CV修剪的可能性。在分析了Laitman等人报告的非EC类型中klf6相关转录本的可用RNAseq谱后。我们发现两个肌动蛋白相关基因被klf6下调：活性调节的细胞骨架相关蛋白（Arc）和转凝胶蛋白2（Tagln2）。Tagln2表达在斑马鱼胚胎的脉管系统中富集。因此，我们推测tagln2可能是klf6a 缺失的下游靶标，用于调节斑马鱼胚胎的CV修剪。为了支持这一假设，我们发现敲除siKLF6的klf6在体外mRNA和蛋白质水平上降低了TAGLN2表达（图4-7（a），（b））。此外klf6a纯合突变体在36 hpf时显示CVP区域中tagln2的mRNA减少，如WISH所确定的（图4-7（c））。为了确认tagln2是否是斑马鱼中 klf6a 的直接靶标，我们进行了生物信息学分析以预测斑马鱼tagln2启动子内转录因子 klf6a可以结合的潜在序列。如图4-7（d）所示，klf6a可以结合的三个CACCC序列位于tagln2启动子的-1 977至-1 643 bp区域。然后我们对斑马鱼胚胎进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析以验证这一点。结果表明，klf6a可以与tagln2基因内的该启动子区域结合，但不能与外显子1结合（图4-7（e））。这些结果表明tagln2是斑马鱼 klf6a 的直接下游靶标，这表明tagln2可能参与klf6a介导的CV修剪。
图4-7 Tagln2是klf6a的直接下游目标。（a）和（b）HUVEC中的 siKLF6 在 mRNA（klf6: p=0.000 9, tagln2: p=0.035 2）和蛋白质（klf6: p＜0.000 1, tagln2: p＜0.000 1）水平上有效降低 TAGLN2表达，t检验。*p＜0.05，***p＜0.001。（c）36 hpf 时sibling和klf6a-/-斑马鱼的 tagln2 基因的表达。箭头表示表达 tagln2的CVP区域。（d）tagln2 启动子的结构。引物tagln2-F1+R1 含有保守的Klf6a结合侧CACCC，而tagln2-F2+R2是位于tagln2外显子 1 的阴性对照。（e）tagln2启动子的 ChIP-PCR显示Klf6a可以直接结合tagln2启动子。［引自：王贵学. Flow-dependent vessel pruning governs zebrafish CV formation by klf6a/tagln2 axis［C］. 第七届中美生物医学工程与生物力学研讨会大会报告. 重庆, 2019.］
Figure 4-7 Tagln2 is a direct downstream target of klf6a.（a）and（b）siKLF6 in HUVECs efficiently decrease tagln2 expression at the mRNA（klf6: p=0.000 9, tagln2: p=0.035 2）and protein（klf6: p＜0.000 1, tagln2: p＜0.000 1）levels. Student’s unpaired two-tailed t test. *p＜0.05, ***p＜0.001.（c）WISH of the tagln2 gene of sibling and klf6a-/-zebrafish at 36hpf. Arrowheads indicate the CVP region expressing tagln2.（d）Structure of the tagln2 promoter. The primer tagln2-F1+R1 contains the conserved Klf6a binding side-CACCC, whereas tagln2-F2+R2 is a negative control located in the tagln2 exon 1.（e）ChIP-PCR of the tagln2 promoter shows that klf6a can bind directly to the tagln2 promoter.［Adapted from: Guixue Wang. Flow-dependent vessel pruning governs zebrafish CV formation by klf6a/tagln2 axis［C］. The 7th Sino-American Workshop on Biomedical Engineering and Biomechanics. Chongqing, 2019.］
为了确定tagln2在斑马鱼CV修剪中的作用，我们首先使用tagln2-EGFP融合蛋白验证了tagln2-MO的效率，其表达明显被tagln2-MO抑制。然后使用该MO敲低胚胎中的tagln2基因以评估对72 hpf的CV修剪的影响，MO对tagln2的破坏在72 hpf时增加了CV中血管环的数量（平均环：对照=0.6，tagln2-MO=1.461 5）。为了进一步验证tagln2在CV修剪中的作用，我们随后使用CRISPR/cas9 技术在斑马鱼中生成了tagln2突变体，其中从外显子1中删除了7 bp 片段。与WT相比，tagln2纯合突变显示在72 hpf时CV处的血管环数量显著增加（平均环：WT=0.44，tagln2-/-=1.818 18；图4-8（a），（b））。
接下来，我们使用Tg（fli1a:nEGFP;kdrl:mCherry）胚胎的延时实时成像分析了tagln2对EC行为的影响。在注射MO的对照胚胎中，在48—54 hpf的回归血管分支内，可以很容易地观察到EC核逆血流迁移（白色圆圈）（图4-8（c））。然而，在tagln2 morphant中，EC细胞核（白色圆圈）从48～58 hpf 没有明显的运动（图4-8（c））。MO对tagln2的敲低导致EC核减少38%（对照：n=14/24 ECs，tagln2-MO：n=3/15 ECs）逆血流迁移，EC核增加3%（对照：n=4/24 ECs，tagln2-MO：n=3/15 ECs）随血流迁移，ECs 核增加35%（对照：n=6/24 ECs，tagln2-MO：n=9/15 ECs）没有迁移（图4-8（d））。这些结果有力地支持了我们的主张，即通过调节EC核迁移来进行CV修剪需要tagln2。为了评估tagln2对体外EC迁移的影响，我们使用siTAGLN2使培养的HUVEC中的tagln2沉默，发现 tagln2表达在mRNA（图4-8（e））和蛋白质（图4-8（f））水平上均受到显著抑制。为评估tagln2对 HUVEC中EC迁移的影响而进行的伤口愈合试验的结果表明，siRNA对tagln2的敲低显著抑制了HUVEC中的EC迁移（图4-8（g））。以上我们的结果表明，tagln2作为klf6a的下游靶标，通过促进EC细胞核迁移来调节斑马鱼的CV修剪。
图4-8 Tagln2通过促进EC核迁移来调节CV修剪。（a）tagln2在斑马鱼胚胎CV修剪中的作用。方框显示了放大图像。箭头表示未修剪的血管。比例尺：50 μm。（b）sibling和tagln2-/-胚胎中血管环的量化：sibling，n=25 个胚胎；tagln2-/-，n=23个胚胎。p=0.000 4。t检验。（c）Tg（fli1a:EGFP;kdrl:mCherry）胚胎的延时实时成像显示控制或tagln2 morphant中CV修剪中的EC核迁移。箭头表示血流方向。彩色圆圈表示EC核。比例尺：10 μm。（d）回归血管中EC核迁移的方向。方向分为顺流、静流、逆流三种。在对照组和tagln2 morphant中分别计算了总共12个血管袢和24个EC核和8个血管袢和15个EC核。卡方检验。p=0.047 1。（e）和（f）siTAGLN2在HUVEC中的mRNA（p=0.009 4）和蛋白质（p＜0.000 1）水平的效率。（g）siCTR 转染和 siTAGLN2转染HUVEC的伤口愈合。siCTR和siTAGLN2转染后伤口愈合的统计数据：6 h，p=0.003 7；12 h，p=0.025 2。E-G t 检 验。*p＜0.05，*p＜0.01，***p＜0.001。［引 自：王 贵学.Flow-dependent vessel pruning governs zebrafish CV formation by klf6a/tagln2 axis［C］. 第七届中美生物医学工程与生物力学研讨会大会报告. 重庆, 2019.］
Figure 4-8 Tagln2 regulates CV pruning by promoting EC nucleus migration.（a）Role of tagln2 in CV pruning in zebrafish embryos. Boxes show enlarged images of the CV. The arrowhead indicates unpruned vessel. Scale bar: 50 μm.（b）Quantification of vascular loops in sibling and tagln2-/-embryos: sibling, n=25 embryos; tagln2-/-, n=23 embryos. p=0.000 4. Student’s unpaired two-tailed t test.（c）Time-lapse live imaging of Tg（fli1a:EGFP;kdrl:mCherry）embryos shows EC nucleus migration in CV pruning in control or tagln2 morphant. Arrows indicate the direction of the blood flow. Colored circles indicate the EC nuclei. Scale bar: 10 μm.（d）Direction of EC nucleus migration in the regressing vessel. The direction is classified into three types: with the flow, static, and against the flow. A total of 12 vascular loops with 24 EC nuclei and 8 vascular loops with 15 EC nuclei were calculated in the control group and tagln2 morphant, respectively. Unpaired two-tailed chi-square test. p=0.047 1.（e）and（f）Efficiency of siTAGLN2 in HUVECs at the mRNA（p=0.009 4）and protein（p＜0.000 1）levels.（g）Wound healing of siCTR-transfected and siTAGLN2-transfected HUVECs. Statistics for wound healing after siCTR and siTAGLN2 transfection: 6 h, p=0.003 7; 12 h, p=0.025 2. E-G Student’s unpaired two-tailed t test. *p＜0.05, *p＜0.01, ***p＜0.001.［Adapted from: Guixue Wang. Flow-dependent vessel pruning governs zebrafish CV formation by klf6a/tagln2 axis［C］. The 7th Sino-American Workshop on Biomedical Engineering and Biomechanics. Chongqing, 2019.］