4.2.2 微重力影响血管发育的分子机制
在斑马鱼的血管系统发育过程中，包括两个阶段，血管发生和血管生成。血管发生这个阶段是从12 hpf到24 hpf，血管生成过程是在24 hpf过后，到36 hpf时血管脉络基本形成。在24—36 hpf这个阶段，血液循环刚刚建立，这个阶段是血管生成的重要阶段，因为有微重力这个力学因素的刺激作用，心率发生改变，提示血管生成阶段可能会受到影响。从以上研究可看出，模拟微重力确实对斑马鱼胚胎血管发育造成了一定的影响。
在太空环境中，宇航员由于受到微重力的影响，血液流体静压差消失，体液转向头部，血液重新分布，这种变化会引起血管内皮细胞中eNOS表达上调，NO释放量增加，血管扩张，这其实是一种适应性的反应，但如果这种适应性反应在返回地球后，没有迅速恢复正常，则可能导致宇航员立位耐力不良。细胞学实验证明，模拟微重力对内皮细胞的功能有多方面的影响，包括：刺激内皮细胞的增殖、凋亡、迁移和细胞骨架的重塑，从而影响细胞运动。陈荣贵在研究中表明，模拟微重力不仅可促进内皮细胞的凋亡，还可以使大鼠动静脉区域的血管发生重构，进一步引起内皮细胞中的一些基因表达改变及分泌的NO增加。另外，由于模拟微重力明显刺激NO的合成，从而对NOS的活性产生显著影响。其中eNOS大量表达于心血管系统的内皮细胞中，不仅参与到NO的生成中，还是内皮细胞依赖的各种反应中不可缺少的信号分子。另外研究中证实，回转模拟失重会影响肺微血管eNOS的表达升高和NO的合成的增多。eNOS与机体的血管新生关系十分密切。阻断eNOS基因表达或抑制eNOS生成会减少模式动物新生血管的形成。
研究显示，微重力从12 hpf开始处理斑马鱼，在36 hpf时，SM组NO浓度表达显著高于对照组（图4-13（b））。这一发现提示NO信号通路可能参与SM调控斑马鱼血管发育过程。进一步研究显示，在斑马鱼1—4细胞期将NOS2b MO注射到斑马鱼胚胎中，然后使用SM处理斑马鱼胚胎至36 hpf。在NOS2b MO组中，CVP的宽度、CVP的毛细管间数和CVP的毛细管间面积均显著减小（图4-13（a）, （c）—（e）），且胚胎中flk1的表达显著降低（图4-13（f）, （g））。以上结果显示NOS2b是SM调控斑马鱼CVP网络形成过程中的下游因子。
PI3K（phosphoinositide3-kinase，3-磷酸肌醇激酶）-Akt（蛋白激酶B，PKB）信号通路是细胞内经典的信号转导重要的通路之一，是细胞存活很重要的通路。PI3K是一种胞内磷脂酞肌醇激酶，它可以特异地使肌醇环上的3′-羟基磷酸化。PI3K激活后可通过一系列级联反应激活Akt，及其下游信号的级联反应，参与生长、发育、分化和细胞的存活。研究发现，大脑缺氧缺血损伤后，会抑制PI3K/Akt通路，并且能显著下调血管内皮生长因子（VEGF）的表达，表明PI3K/Akt信号通路在脑缺氧缺血后大脑内环境调控以及组织修复中起到重要作用。且PI3K/Akt细胞信号传导通路在内皮细胞的增殖、分化、黏附、凋亡、血管形成等方面具有重要的作用。最近研究表明，PI3K抑制剂（LY294002）处理斑马鱼后，CVP毛细管网络结构不能成型（图4-14（a）），CVP的宽度、毛细管间数和毛细管间面积明显减小（图4-14（a）—（d））。在36 hpf时，LY294002组胚胎CVP区域的flk1表达显著降低（图4-14（e）, （f））。研究还发现将SM和LY294002共处理可以部分挽救由LY294002引起的CVP网络结构缺失（图4-14（a）—（d））和flk1的表达（图4-14（e）, （f））。SM诱导的CVP网络结构生成可以通过PI3K信号实现。
图4-13 NOS2b是SM调节CVP网络形成的关键因素。（a）36 hpf时胚胎的荧光显微镜图像。侧视图，左前，背侧向上。CVP用白色箭头表示。比例尺，100 μm。下图显示了上方图像CVP区域的放大图。红色箭头表示毛细血管网络结构。比例尺，50 μm。（b）SM和控制条件下36 hpf斑马鱼的NO浓度。（均数±标准差，t检验，*p＜0.05）。（c）计算毛细血管网络数。每个处理用30个胚胎进行计数。（均数±标准差，t检验，***p＜0.001）。（d）定量毛细管间面积百分比。每个处理用30个胚胎进行测量。（均数±标准差，t检验，***p＜0.001）。（e）测量CVP的宽度。每个处理用30个胚胎被用于测量。（均数±标准差，t检验，**p＜0.01）。（f）斑马鱼在36 hpf时flk1相对表达的qPCR结果。（均数±标准差，t检验，***p＜0.001）。（g）SM可以挽救注射NOS2b MO的flk1表达。比例尺，100 μm。［引自：Xie X, et al. Effect of simulated microgravity induced PI3K-nos2b signalling on zebrafish cardiovascular plexus network formation［J］. J Biomech, 2019 (87): 83-92.］
Figure 4-13 NOS2b is the key factor that SM regulates the formation of CVP network.（a）Fluorescence microscope image of embryo at 36 hpf. Side view, front left, back side up. CVP is indicated by a white arrow. Scale bar, 100 μm. The image below shows an enlarged view of the CVP area of the upper image. The red arrow indicates the capillary network structure. Scale bar, 50 μm.（b）NO concentration of 36 hpf zebrafish under SM and control conditions.（Mean ± standard deviation, t test, *p＜0.05）.（c）Calculate the number of capillary network. Thirty embryos were counted for each treatment.（Mean ± standard deviation, t test, ***p＜0.001）.（d）Percentage of area between quantitative capillaries. 30 embryos were used for the measurement per treatment.（Mean±standard deviation, t test, ***p＜0.001）.（e）Measure the width of CVP. Thirty embryos per treatment were used for measurement.（Mean±standard deviation, t test, **p＜0.01）.（f）The qPCR result of the relative expression of flk1 in zebrafish at 36 hpf.（Mean±standard deviation, t test, ***p＜0.001）.（g）SM can rescue the expression of flk1 injected with nos2b MO. Scale bar, 100μm.［Adapted from: Xie X, et al. Effect of simulated microgravity induced PI3K-NOS2b signalling on zebrafish cardiovascular plexus network formation［J］. J Biomech, 2019 (87): 83-92.］(https://www.daowen.com)
图4-14 SM通过PI3K信号调节CVP网络形成。（a）在36 hpf时，用荧光显微镜观察LY294002对CVP网络形成的影响。侧视图，左前，背侧向上。CVP用白色箭头表示。比例尺，100 μm。下图为上方图像CVP区域的放大图。红色箭头表示毛细血管网络结构。比例尺，50 μm。（b）LY294002组的毛细管网络明显减少，SM可以部分挽救（n=30）。（均数±标准差，t检验，***p＜0.001）。（c）定量毛细管网络面积百分比（n=30）。（均数±标准差，t检验，***p＜0.001）。（d）测量CVP的宽度。每个处理有30个胚胎被用于测量。（均数±标准差，t检验，**p＜0.01）。（e）斑马鱼flk1在36 hpf相对表达的qPCR结果。（均数±标准差，t检验，***p＜0.001）。（f）36 hpf时，尾部区域flk1全胚原位杂交。比例尺，100 μm。［引自：Xie X, et al. Effect of simulated microgravity induced PI3K-nos2b signalling on zebrafish cardiovascular plexus network formation［J］. J Biomech, 2019 (87): 83-92.］
Figure 4-14 SM regulates the formation of CVP network through PI3K signal.（a）At 36 hpf, the effect of LY294002 on the formation of CVP network was observed with a fluorescence microscope. Side view, front left, back side up. CVP is indicated by a white arrow. Scale bar, 100 μm. The image below is an enlarged view of the CVP area of the upper image. The red arrow indicates the capillary network structure. Scale bar, 50 μm.（b）The capillary network of the LY294002 group is significantly reduced, and SM can be partially rescued（n=30）.（mean ± standard deviation, t test, ***p＜0.001）.（c）Quantitative capillary network area percentage（n=30）.（mean±standard deviation, t test, ***p＜0.001）.（d）Measure the width of CVP. Thirty embryos per treatment were used for measurement.（Mean±standard deviation, t test, **p＜0.01）.（e）The qPCR result of the relative expression of zebrafish flk1 at 36 hpf.（Mean±standard deviation, t test, ***p＜0.001）.（f）At 36 hpf, the tail region flk1 whole in situ hybridization. Scale bar, 100 μm.［Adapted from: Xie X, et al. Effect of simulated microgravity induced PI3K-nos2b signalling on zebrafish cardiovascular plexus network formation［J］. J Biomech, 2019 (87): 83-92.］
对内皮细胞而言，多种外源性刺激因素均可以通过PI3K-Akt信号途径诱导eNOS的磷酸化，导致其活化和随后的NO生成增多，进而发挥生理、病理作用。在参与模拟失重条件下HUVECs血管生成能力增强的发生过程中PI3K-Akt信号通路通过调节的表达和活性发挥着关键作用。最新研究显示在PI3K被抑制后NO浓度显著降低（图4-15（a））。推测PI3K信号通路可以调控NOS2b活性，从而介导CVP网络的形成。进一步研究表明，在PI3K抑制剂处理后，CVP被抑制，不能与相邻的血管连接，而LY294002+nos2b mRNA组中CVP未见明显血管异常（图4-15（d））。NOS2b mRNA可以部分回救由于LY294002处理导致的CVP的宽度、毛细管间数和毛细管间面积及flk1表达的减小（图4-15（b）, （c）, （e）, （f））。以上研究表明，NOS2b mRNA部分挽救了斑马鱼胚胎中LY294002诱导的CVP网络形成缺失。全胚原位杂交也显示了同样的结果（图4-15（g））。这些发现提示SM通过PI3K-nos2b信号通路调控CVP网络的形成。
图4-15 SM介导的PI3K通过调控NOS2b调节斑马鱼CVP网络形成过程。（a）36 hpf检测斑马鱼NO浓度。（均数±标准差，t检验，**p＜0.01）。（b）NOS2b mRNA部分回救LY294002处理后胚胎的毛细血管网络数（n=30）。（均数±标准差，t检验，***p＜0.001）。（c）NOS2b mRNA也能部分拯救毛细血管面积百分比（n=30）。（均数±标准差，t检验，***p＜0.001）。（d）36 hpf时胚胎的荧光显微镜图像。侧视图，左前，背侧向上。CVP用白色箭头表示。比例尺，100 μm。下图显示了图像上方CVP区域的放大图。红色箭头表示毛细血管网络。比例尺，50 μm。（e）可以通过nos2b mRNA恢复CVP的宽度（n=30）。（均数±标准差，t检验，***p＜0.001）。（f）斑马鱼在36 hpf时flk1相对表达的qPCR结果。（均数±标准差，t检验，***p＜0.001）。（g）36 hpf时，尾部区域flk1全原位杂交。比例尺，100 μm。［引自：Xie X, et al. Effect of simulated microgravity induced PI3K-nos2b signalling on zebrafish cardiovascular plexus network formation［J］. J Biomech, 2019, 87: 83-92.］
Figure 4-15 SM-mediated PI3K regulates the formation of the zebrafish CVP network by regulating NOS2b.（a）36 hpf detects NO concentration in zebrafish.（Mean±standard deviation, t test, **p＜0.01）.（b）NOS2b mRNA partially rescues the number of capillary networks of embryos treated with LY294002（n=30）.（mean±standard deviation, t test, ***p＜0.001）.（c）NOS2b mRNA can also partially rescue the percentage of capillary area（n=30）.（mean ± standard deviation, t test, ***p＜0.001）.（d）Fluorescence microscope image of embryo at 36 hpf. Side view, front left, back side up. CVP is indicated by a white arrow. Scale bar, 100 μm. The image below shows a magnified view of the CVP area above the image. The red arrow indicates the capillary network. Scale bar, 50 μm.（e）The width of CVP can be restored by nos2b mRNA（n=30）.（mean±standard deviation, t test, ***p＜0.001）.（f）The qPCR result of the relative expression of flk1 in zebrafish at 36 hpf.（Mean±standard deviation, t test, ***p＜0.001）.（g）whole in situ hybridization of flk1 in the tail region at 36 hpf. Scale bar, 100 μm.［Adapted from: Xie X, et al. Effect of simulated microgravity induced PI3K-nos2b signalling on zebrafish cardiovascular plexus network formation［J］. J Biomech, 2019, 87: 83-92.］