4.1.1 血流动力学对血管发育的影响
（1）血流动力学调节血管发育
在血管发育的过程中，自从建立血液循环开始，原始的血管丛就表现出极大的可塑性。血流量大的血管加宽加粗，有的血流量小的血管就干脆直接消失不见，而有的血管片段则开始断开连接形成新的血管片段。并且在高血流量的区域一般是伴随有极强的血管分支生成的趋势，在最初的原始血管的基础上，小动脉和小静脉的分支形成以及毛细血管网络的建成都是和血流动力学因素相关的。尽管斑马鱼血管发育过程中，在开始还没有建立血液循环的情况下还是可以形成主动脉和主静脉，但是最近也有研究发现，主动脉弓血管的发育还是要依赖于血流动力学因素。此外，血流动力学最近被证明也会影响斑马鱼侧支动脉循环的形成过程。
在我们的前期研究中，我们发现血流动力学的改变显著的影响斑马鱼尾部静脉丛（caudal vein plexus, CVP）血管的发育。如图4-1（a）所示，在实验对照组中我们可以看到，尾静脉（ventral vein，VV，黄色箭头）管腔平滑饱满，CVP网络结构清晰，但是在抑制剂处理组中尾部静脉丛没有成型，血管外形不规则，没有完整的网络结构形成。CVP的量化分析结果显示，抑制剂处理后CVP的血管新生受到显著的抑制（图4-1（c））。如图4-1（b）和图4-1（d）所示，通过注射tnnt2a-吗啉代寡核苷酸（morpholino oligonucleotides，MO）抑制心脏跳动，导致斑马鱼胚胎无血流运动，其CVP发育明显被抑制。
图4-1 血流动力学调节斑马鱼胚胎CVP血管生成。（a）血流调节剂（硝苯地平）：1 mM，（三卡因：2 mM）处理抑制CVP血管新生。转基因Tg（flk1:GFP）胚胎在受精24 h后（hour post fertilization，hpf）用化学物质处理并通过在体共聚焦显微镜在36 hpf成像。显示了药物处理后的代表性实例。侧面视图，前左，背向上。CVP用黄色箭头标记。比例尺100 μm。下图显示CVP的放大图。VV由红色箭头显示。比例尺50 μm。（b）tnnt2a-MO对24 hpf和36 hpf时CVP形成的影响。向斑马鱼胚胎注射tnnt2a-MO，并使用共聚焦显微镜在24 hpf和36 hpf下成像。侧面视图，前部向左，背向上。CVP使用黄色箭头标记。比例尺，100 μm。下图显示为36 hpf时CVP区域的放大图。VV用红色箭头显示。比例尺50 μm。（c）包含CVP的体节的百分比。在每种处理中，使用30个胚胎进行定量。硝苯地平或三卡因阻断了CVP的形成和VV的融合。（平均值±SD，t检验，***p＜0.001）。（d）包含CVP的体节的百分比，在对照MO（n=56）和tnnt2a-MO（n=49）注射的胚胎中定量。tnnt2a-MO在很大程度上阻止了CVP血管生成。（平均值±SD，t检 验，***p＜0.001）。［引 自：Xie X, et al. Blood flow regulates zebrafish caudal vein plexus angiogenesis by ERK5-klf2a-nos2b signaling［J］. Curr Mol Med, 2018, 18（1）: 3-14.］
Figure 4-1 Hemodynamics regulates zebrafish embryos CVP angiogenesis.（a）Treatment with a blood flow regulator（nifedipine: 1 mM, tricaine: 2 mM）treatment inhibits CVP angiogenesis. Transgenic Tg（flk1:GFP）embryos were treated with chemicals 24 hours after fertilization（hour post fertilization, hpf）and imaged at 36 hpf by in vivo confocal microscope. A representative example after drug treatment is shown. Side view, front left, back up. CVP is marked with a yellow arrow. The scale bar is 100 μm. The image below shows an enlarged view of CVP. VV is shown by the red arrow. The scale bar is 50 μm.（b）The effect of tnnt2a-MO on the formation of CVP at 24 hpf and 36 hpf. Zebrafish embryos were injected with tnnt2a-MO and imaged at 24 hpf and 36 hpf using a confocal microscope. Side view, front left and back up. CVP is marked with a yellow arrow. Scale bar, 100 μm. The figure below shows an enlarged view of the CVP area at 36 hpf. VV is shown with a red arrow. The scale bar is 50 μm.（c）Percentage of body segments containing CVP. In each treatment, thirty embryos were used for quantification. Nifedipine or tricaine blocked the formation of CVP and the fusion of VV.（Mean±SD, t test, ***p＜0.001）.（d）The percentage of somites containing CVP, quantified in control MO（n=56）and tnnt2a-MO（n=49）injected embryos. tnnt2a-MOs prevented CVP angiogenesis to a large extent.（Mean ± SD, t test, ***p＜0.001）.［Adapted from: Xie X, et al. Blood flow regulates zebrafish caudal vein plexus angiogenesis by ERK5-klf2a-nos2b signaling［J］. Curr Mol Med, 2018, 18（1）: 3-14.］(https://www.daowen.com)
由于目前实验条件和实验手段的限制，在体的研究血流动力学对血管发育的影响在方法手段上还有一定的限制。目前有很多的研究是利用注射tnnt2a-MO斑马鱼（没有心跳）作为研究对象，由于没有心跳那么最初的血液循环就没有，这样用来研究没有血液循环对血管发育的影响。另外还有一些研究是通过激光切断血管或者对血管进行结扎观察血流动力学对血管生成的影响，但是这些研究都还是不能调节血流的大小，更不能对其定量，只能观察没有血流的情况对血管发育的影响，不能更进一步的研究血流和血管发育之间的关系。目前有一种方案是借助可以调节血流动力学大小的化学抑制剂，发现血流是可以调节血管发育过程的。那么药物抑制剂本身是否会导致血管发育的畸形？最新研究结果发现，在同样的化学抑制剂浓度下，斑马鱼血管发育畸形，但是实验处理组和对照组斑马鱼外观形态和存活率并没有显著性的变化。因此，尽管化学抑制剂可能对斑马鱼本身发育有一定的影响，但是并不显著，因此血管发育的严重畸形很大程度上是由于血流动力学的改变引起的。
（2）血流动力学各个因素与血管发育之间的关系
随着血流量、血液流速以及血流切应力的减少，CVP血管生成也是减少的。但是血流量、血液流速的改变和CVP血管生成并不是呈线性关系的；而血流切应力和CVP血管生成基本是呈线性关系的，这说明这三种血流动力学因素都是参与了力学调节CVP血管发育过程的，并且血流切应力的变化是最能直接反应CVP血管发育变化的血流动力学因素（图4-2）。血流量、血流流速以及血流切应力在一定范围内改变的时候（血流量减少到65 pL/s以前、血流流速减少到220 μm/s以前、血流切应力减少到0.86 dyn/cm2以前的数值），CVP血管发育是没有特别显著性的变化的，但是一旦这几个因素低于这个值的时候，CVP血管发育就受到极大的影响。血流量、血流流速以及血流切应力只要是维持在能够满足机体基本发育所需要的量的情况下，对血管发育基本没有显著的影响。但是一旦低于一定的值，连基本的养分和含氧量都不能满足的话，血管发育就受到很大的影响。那么在不同的生物体血管发育中是否都有这样一个阈值，只要达到阈值以上那么对血管发育是没有很大影响的，但一旦低于这个阈值血管发育就会产生畸形。这个阈值在血管发育和血管疾病发生发展中占有多重要的作用还需要进一步研究证实，这也可能为血管发育包括疾病的预防治提供新的线索和靶标。
图4-2 三种血流动力学因素和CVP的百分比的关系。26～36 hpf的胚胎（n=30）经过三卡因的梯度浓度（从0 mM至2.25 mM）处理，不同的颜色表示浓度（平均值±标准差，与对照，方差分析，***p＜0.001和**p＜0.01，n=3）。（a）血流量和CVP的百分比具有非线性关联关系。（b）血液流速和CVP的百分比具有非线性关联关系。（c）流体切应力与CVP的百分比具有线性关系。［引自：Xie X, et al. Blood flow regulates zebrafish caudal vein plexus angiogenesis by ERK5-klf2a-nos2b signaling［J］. Curr Mol Med, 2018, 18（1）: 3-14.］
Figure 4-2 The relationship between the three hemodynamic factors and the percentage of CVP. 26-36 hpf embryos（n=30）were treated with a gradient concentration of tricaine（from 0 mM to 2.25 mM）, and different colors indicate the concentration（mean ± standard deviation, significant and control, analysis of variance, ***p＜0.001 and **p＜0.01, n=3）.（a）There is a non-linear correlation between blood flow and the percentage of CVP.（b）The blood flow rate and the percentage of CVP have a non-linear correlation.（c）The fluid shear stress has a linear relationship with the percentage of CVP.［Adapted from: Xie X,et al. Blood flow regulates zebrafish caudal vein plexus angiogenesis by ERK5-klf2a-nos2b signaling［J］. Curr Mol Med, 2018, 18（1）: 3-14.］