3.4.4 支架材料表面介导再内皮修复的分子机制研究
血管内皮细胞黏附和迁移是心血管材料植入后内皮化修复的重要过程，而细胞和材料的表面细胞与材料的表/界面相互作用是决定其黏附/迁移的关键。通过对材料表面理化性质的设计来调控细胞黏附、迁移等生物学行为从而加速内皮化进程，是当今细胞生物力学研究的焦点，但其分子机制尚未明确。材料学因素（包括成分、结构、表面化学、微结构等）与化学信号和机械刺激产生的力学信号一样，可参与调控蛋白或基因表达的级联激活，从而调节细胞的黏附、迁移、增殖和分化等生物学行为。材料植入后表/界面与蛋白质、细胞的相互作用取决于材料本体和表面的结构特征以及植入后所处的微环境。大量研究表明，材料表面的理化性质，如表面形貌和粗糙度、化学官能团、能量状态及亲/疏水性、电荷种类及分布等均会影响细胞在其表面的黏附数量和状态。然而，材料表面性质通过调控细胞迁移修复内皮层的研究较少。
（1）亲疏水性材料表面介导细胞黏附迁移的分子机制
亲疏水材料表面对血管内皮细胞黏附和迁移的影响。亲水的材料表面（1∶2～1∶5样品组）更有利于细胞的黏附，但细胞在疏水的材料表面伸出明显的丝状和板状伪足，呈现迁移的趋势。采用划痕实验、细胞迁移距离、迁移细胞数目和最终愈合时间等参数的统计结果均证实：疏水的等离子体SiOx∶H表面（1∶0和1∶1样品）更有利于血管内皮细胞的迁移。通过30 min的连续观察结果同时也证明了细胞在疏水的材料迁移速率大于亲水表面。细胞在不同润湿性材料表面的黏附和迁移呈现出相反的行为。
局部黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）在血管内皮细胞黏附和迁移中的作用。通过测定不同浓度的FAK抑制剂对VECs黏附和迁移以及下游小G蛋白表达情况，发现抑制FAK使VECs伪足收缩，胞核突出，胞间连接被打断，细胞易脱黏附。FAK抑制剂的加入使细胞迁移行为被明显抑制，FAK抑制剂浓度越大，细胞迁移距离越小，呈浓度依赖性。随着FAK抑制浓度的增加，Rac1蛋白表达逐渐减弱，进一步证实了血管内皮细胞的黏附和迁移与FAK-Rho GTPases信号轴相关。选用50 nm/mL 的FAK抑制剂浓度对VECs在不同润湿性的SiOx∶H纳米膜层的迁移进行测定，结果证明血管内皮细胞在不同润湿性材料表面的迁移均依赖于FAK在Y397的酪氨酸磷酸化及其所介导的下游信号通路。
材料表面亲疏水性对FAK-Rho GTPases信号通路相关蛋白表达和分布的影响。采用Western blot结合免疫荧光研究材料表面亲疏水性对FAK-Rho GTPases 信号通路中关键信号蛋白分布和表达的影响进行测定。其结果证明：亲疏水性材料表面引起细胞膜表面受体Integrin α、β亚基的不同表达，进而影响下游Talin、pFAK、小G蛋白中的Rac1、RhoA和Cdc42对亲疏水性材料表面的不同响应（图3-6）。通过对几种蛋白表达的统计结果证实：血管内皮细胞在不同亲疏水材料表面的黏附和迁移依赖于细胞中关键酶FAK在397位点酪氨酸的磷酸化作用。细胞在疏水材料表面的迁移与FAK-Rho GTPases信号通路相关，在亲水材料表面则不确定完全与该通路相关。其中，1∶2样品（θ=47.5±3.0°）是转折点。
图3-6 免疫荧光双染法分析不同亲（1∶3～1∶5）疏水（1∶0～1∶2）等离子体沉积SiOx∶H涂层表面对VECs细胞Cdc42蛋白（红色荧光）和Talin（绿色荧光）表达和分布的影响。蓝色为DAPI细胞核染色，图中红色标尺=10μm，黄色标尺=25μm ［引自：Shen Y, et al. Integrins-FAK-Rho GTPases pathway in endothelial cells sense and response to surface wettability of plasma nanocoatings［J］. Acs Appl Mater Inter, 2013, 5（11）: 5112-5121.］
Figure 3-6 Immunofluorescence double staining analysis of the effects of SiOx∶H coating surface deposited by different philic （1∶3～1∶5） hydrophobic （1∶0～1∶2） on the expression and distribution of Cdc42 protein （red fluorescence） and Talin （green fluorescence） in VECs cells. Blue is DAPI nuclei staining, red scale=10μm, yellow scale=25μm ［Adapted from: Shen Y, et al. Integrins-FAK-Rho GTPases pathway in endothelial cells sense and response to surface wettability of plasma nanocoatings［J］. Acs Appl Mater Inter, 2013, 5（11）: 5112-5121.］(https://www.daowen.com)
（2）材料表面不同官能团介导细胞黏附迁移的信号通路初探
细胞在迁移过程中涉及一系列复杂的信号通路。研究表明，细胞外基质、Integrin和FAK等信号分子在细胞迁移中发挥着重要作用。材料表面理化性质如表面化学官能团的不同引起细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中黏附成分构象变化的差异，可能刺激细胞在材料表面具有不同的黏附状态和迁移速率。ECM包括层连蛋白（laminin，LN），纤连蛋白（fibronectin，FN）和胶原（collagen）等成分，它们特异性吸附在材料表面，发生构象变化，暴露活性位点，与细胞膜表面黏附受体-整合素（α2β1，α3β1，α5β1和αVβ3等）特异性结合，使整合素活化并募集和磷酸化一系列细胞内蛋白（Talin，Paxillin，Vinculin等），从而将信号传导到细胞内，随后在细胞膜局部形成黏着斑（focal adhesion，FA），FAK也被激活并磷酸化下游的蛋白，如小G蛋白Rho GTPases等，介导一系列信号传导，从而调控细胞的迁移行为。
利用Au-S之间强吸附而制备的自组装单分子层材料（self-assembly monolayers，SAMs）由于能够很好地控制材料表面的化学组成，被认为是研究细胞、蛋白与材料表面相互作用的一种很好的模式材料。通过材料表面沉积的20 nm的Au涂层，与正十二烷基硫醇的S键结合，另一端的CH3、NH2、OH、COOH等化学官能团则暴露在材料表面。采用这一模式材料表面，探讨了材料表面化学对血管内皮细胞黏附、迁移及Integrin-Rho GTPases信号通路上关键蛋白表达和分布的影响规律。研究结果表明，CH3和NH2表面更有利于细胞的迁移，COOH表面细胞迁移距离最小。血管内皮细胞在不同化学官能团的材料表面的迁移均依赖于FAK在Y397位点的酪氨酸磷酸化，且CH3表面对FAK的活化程度最高。CH3、NH2和OH组具有较高的Rac1、RhoA和Cdc42的表达，与细胞水平上迁移结果一致。证实血管内皮细胞在不同化学官能团的材料表面的黏附和迁移行为依赖于Integrin-FAK-Rho GTPases信号通路（图3-7、图3-8）。
图3-7 不同化学官能团的材料表面对VECs迁移和Integrin α和β亚基表达的影响。（a）划痕法测定不同化学官能团的材料表面对VECs迁移的影响。（b）Western blot测定不同化学官能团的材料表面对Integrin亚基（α2、α5、αV、β1、β3）表达的影响及统计结果。［引自：Shen Y, et al. Effect of surface chemistry on the integrin induced pathway in regulating vascular endothelial cells migration［J］. Colloid Surface B, 2015（126）: 188-197.］
Figure 3-7 Effects of material surfaces with different chemical functional groups on VEC migration and Integrin α and β subunit expression. （a）The influence of material surfaces with different chemical functional groups on VEC migration was measured by scratch method. （b）Western blot analysis of the effects of different chemical functional groups on the expression of Integrin subunits （α2、α5、αV、β1、β3） and the statistical results. ［Adapt from: Shen Y, et al. Effect of surface chemistry on the integrin induced pathway in regulating vascular endothelial cells migration［J］. Colloid Surface B, 2015（126）: 188-197.］
图3-8 血管内皮细胞在不同化学官能团的材料表面的黏附和迁移行为依赖Integrin-FAK-Rho GTPases信号通路。［引自：Shen Y, et al. Effect of surface chemistry on the integrin induced pathway in regulating vascular endothelial cells migration［J］. Colloid Surface B, 2015（126）: 188-197.］
Figure 3-8 The adhesion and migration behaviors of vascular endothelial cells on the surface of materials with different chemical functional groups depend on the integrin-fak-rho GTPases signaling pathway. ［Adapt from: Shen Y, et al. Effect of surface chemistry on the integrin induced pathway in regulating vascular endothelial cells migration［J］. Colloid Surface B, 2015（126）: 188-197.］