补肾软坚方药的药物血清制备

由于中药复方成分的复杂性，体内代谢过程中其自身的代谢物及产生的中间产物等潜在的有效成分，均无法在离体实验中被证实，可能造成实验结果的假阳性；此外，粗提物的理化性质（杂质、不可溶成分、pH值、鞣质）对离体反应体系的干扰，也会影响实验结果的准确性。鉴于此，有学者首次提出“中药血清药理学”，即指给动物灌服中药粗制剂一定时间后，经吸收进入机体血液循环，在一定时间内采取血液样本，分离所得血清，该血清含有一定量的中药药物成分，此时的血药浓度反映了机体的真实血药浓度，将血清加入体外细胞培养体系，再观察其药理作用的体外实验的药理学方法。这种实验方法是目前比较常用的一种药理学方法，尤其适用于中药及中药复方研究。

1.血清供体要求　不同种属及同种动物不同类别的动物，其血清成分存在显著差异。笔者科研团队研究发现，不同种属动物血清对同种细胞生长的影响有很大差异，并且血清来源动物种属与其培养细胞的生长没有明显规律。因此，在选择血清制备含药血清时，应选择同种属动物血清，并选用与人类生物学活性近似的物种。另有研究发现，血清来源动物的生理机能差异会对实验结果造成影响，实验结果显示正常状态下大鼠血清与病理状态下其功能有明显差异。所以，为了保证实验结果与在体实验的一致性，血清供体动物应该造模，使其处于与实验相关的病理状态。

2.给药方法、剂量及采血时间　在体外培养给药方面，目前多采用多个时间、多个药物浓度进行观察，根据细胞培养的最大药理学效应确定最佳采血时间和药物浓度。其中，普遍的做法是：给动物喂药（灌胃）1周或10天（或3天），然后禁食禁水，于给药后1小时（或2小时）取血制备血清，常规处理备用。注意，为避免出现食物对中药化学成分的干扰，应采取空腹给药。传统中药复方通用服法为“一剂药煎煮两次后合并药液，每日分两次服用”，制订每日1次的给药方案势必直接影响到该药的疗效，因而中药血清药理学实验多采用1天内多次给药的方案。经研究发现，应用补肾活血中药，给大耳白兔连续灌胃，每4小时1次，完成2次后采血制作血清，其血清药效较常规给药3天后明显低下。综合考虑中药复方成分及其半衰期的不确定性，为保证其在血中浓度维持稳定，故采取7~10天给药方案较为合适。

实验中，含药血清浓度由于离体实验的稀释，无法达到体内药物浓度，可能会导致实验出现假阴性反应。有学者提出可以按照一定的公式计算给药量，给药剂量=临床用药量×动物等效剂量系数（按体表面积）×培养体系内血清的稀释比例。然而不同药物的吸收代谢、半衰期等差异因素使给药剂量的选择也会有差异。通过合理的预实验，寻找最佳的给药剂量，才能有效降低实验误差，保证结果的有效性和科学性。

在采血时间上，由于药物代谢问题，给药后采血时间点的选择成为一个敏感问题。虽然普遍采取1小时（或2小时）采血，但我们研究中发现，大耳白兔每12小时灌胃1次，连续给药96小时，于最末一次给药后1小时即时心脏直接采血，与给药后2小时同样方法采血制作的血清，在药效上存在着明显的差异。对于单味中药、药对及复方的研究，都应进行必要的血清药理学预实验，最终确定合理的方案。

因此，应根据药效特点、药物理化性质、实验指标等因素综合考虑实验动物禁食、给药及血清制备时间。

3.含药血清的处理与保存　血清中存在各种活性成分，如溶酶体、补体等，会对体外培养的细胞、病毒、组织产生影响。其常用的血清灭活方法包括丙酮法、乙醇法、加温法等。然而有学者通过实验研究灭活处理对含药血清的影响，结果发现经过灭活处理后的含药血清，对研究的几种细菌均无抑制作用，而未灭活处理的含药血清可显著抑制或杀灭流感嗜血杆菌、大肠杆菌，故据此猜测血清中补体等活性成分也可能参与中药复方各组分的协同作用。因此，血清灭活是必须的，但需要根据实验的具体要求调整灭活程度。

另有研究发现，血清经长期低温保存（－20℃，2个月）后药效显著降低，提示保存含药血清中药有效成分会发生分解等变化，致使药效成分含量显著降低。如需长期保存，药物血清宜储存于－70℃以下。

4.补肾软坚方药含药血清的制备　根据实验设计的需要，提前计算出实验所需含药血清的量，并计算出所需动物的数量。将若干只健康雄性SD大鼠称重、编号，随机平均分为空白对照组和补肾软坚组。根据临床成人用药剂量，按体表面积比等效剂量折算大鼠用量，约为1.5g/kg。药物用蒸馏水稀释，按10mL/kg体质量灌胃，每日1次，连续7日。空白对照组予等体积的生理盐水灌胃。末次给药2小时后，麻醉，无菌条件下经大鼠腹主动脉取血，室温下静置3小时，3000r/min离心30分钟，分离血清，将同组血清混匀，56℃水浴灭活30分钟，无菌条件下0.22μm微孔滤膜过滤除菌，冻存管分装，取一部分于－20℃保存以供短时间备用，余血清于－80℃冰箱保存。