TSG干预Hcy诱导的内皮细胞凋亡的机制研究
依据中医理论，AS的形成发展多与“脾肾虚衰、痰浊停滞”有关，对AS的治疗当以“益肾健脾、软坚散结”为大法。益肾健脾、软坚散结方药——补肾软坚方药是由阮士怡教授研制，经天津市卫生局批准，在临床上广泛使用，治疗AS疗效肯定的院内制剂。在团队以往的研究中，补肾软坚方药治疗AS有效的相关机制已从抗氧化应激、炎症反应等角度得到初步阐明。团队认为补肾软坚方药还可能通过抑制血管内皮细胞凋亡这一环节抑制AS的形成和发展。本实验在实验一基础上，进一步观察补肾软坚方药有效单体二苯乙烯苷TSG对Hcy诱导的EA.Hy926细胞形态、细胞活力及细胞凋亡相关蛋白表达改变的影响。
（一）材料与方法
1.细胞株 人血脐静脉融合细胞株EA.hy926。
2.主要试剂和药品 胎牛血清（FBS）、同型半胱氨酸（DL-Homocysteine,63M390IV）、噻唑兰（MTT）、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、PMSF蛋白酶抑制剂混合物、BCA法蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒、彩色预染高分子蛋白质分子量标准品、GRP78/BIP抗体（ab21685）、Beta-Actin抗体（bs-0061R）、p-JNK抗体（sc-6254）、CHOP抗体（#2895）、羊抗兔IgG/HRP。
3.方法
（1）细胞培养 同第四章第四节。
（2）MTT定量比色测定细胞活性 同第四章第九节实验二。
（3）Western blotting检测 取传代EA.hy926细胞，消化离心培养，弃细胞上清液，冰上裂解细胞，高速离心得备用蛋白。参照BCA蛋白定量试剂盒及4×SDS-Loading Buffer说明书要求进行蛋白定量与变性，随后SDS-PAGE蛋白电泳分离得蛋白条带数据。
4.统计学方法 用ScnImage软件计算各组蛋白条带的灰度值。标准化蛋白相对表达倍数值=（实验组目的蛋白条带灰度值÷该组内参蛋白条带灰度值）÷（Control组目的蛋白条带灰度值÷Control组内参蛋白条带灰度值）。将各次实验计算得出的标准化蛋白相对表达倍数值用SPSS 17.0软件进行分析，计量数据以x±s表示，组间比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有显著性。
（二）结果
1.TSG对Hcy诱导的血管内皮细胞形态的影响 如图4-49所示，在倒置相差显微镜下观察到c组和t组细胞生长情况良好，细胞形态饱满，有立体感，数目较多，排列密集，细胞呈梭形或多角形，贴壁牢固；Hcy处理后，m组细胞数明显减少，排列疏松，细胞内颗粒物质增多，细胞增殖能力减弱；予TSG预孵育后，t+h组细胞状态介于c组和m组之间，说明TSG可在一定程度上减轻Hcy处理后的细胞形态、排列和增殖能力的改变。
图4-49 TSG对 Hcy诱导的血管内皮细胞形态的影响（200×）
2.TSG对Hcy诱导的血管内皮细胞存活率的影响 如附录图4-50所示，实验表明，EA.hy926细胞经Hcy处理后，细胞存活率明显降低。与m组细胞相比，给予TSG干预后能明显升高Hcy诱导的内皮细胞的活力及细胞存活率的下降，差异具有显著性（P＜0.05）。
3.TSG对Hcy诱导的内皮细胞GRP78蛋白相对表达水平的影响 如附录图4-51所示，Western blotting结果显示，m组内质网应激标志性蛋白GRP78表达较c组明显升高（P＜0.01）。相比m组，TSG处理后，GRP78蛋白表达明显降低（P＜0.05），表明TSG对Hcy诱导的内质网应激具有抑制作用。
4.TSG对Hcy诱导的内皮细胞IRE1蛋白相对表达水平的影响 如附录图4-52所示，Western blotting结果显示，m组内质网应激信号分子IRE1表达较c组明显升高（P＜0.01）。TSG处理后，与m组相比，IRE1蛋白表达降低（P＜0.05），差异具有显著性。
5.TSG对Hcy诱导的内皮细胞p-JNK蛋白相对表达水平的影响 如附录图4-53所示，实验结果表明，m组MAPK信号分子p-JNK表达较c组明显升高（P＜0.01）。TSG处理后，与m组相比，p-JNK蛋白表达降低（P＜0.05），差异具有显著性。
6.TSG对Hcy诱导的内皮细胞CHOP蛋白表达水平的影响 如附录图4-54所示，实验结果表明，m组凋亡信号分子CHOP表达较c组明显升高（P＜0.05）。TSG处理后，与m组相比，CHOP蛋白表达降低（P＜0.05），差异具有显著性。
（三）讨论
本实验观察了补肾软坚方药有效单体TSG对Hcy诱导的内皮细胞形态、细胞活力及细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结果表明，经Hcy处理后，GRP78、IRE1、p-JNK、CHOP蛋白表达明显升高，相比m组，t+h组能明显提高经Hcy处理后的细胞活力，下调GRP78、IRE1、p-JNK、CHOP蛋白的表达，起到保护内皮细胞，抑制内皮细胞凋亡的作用。
TSG是从寥科植物何首乌的干燥块根中提取的水溶性生物活性成分，研究表明TSG具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、促进毛发生长、提高记忆力与学习能力等作用。近些年来，TSG在抗动脉粥样硬化方面被人们广泛关注，但其作用机制仍不明确，故本研究选择TSG作为干预药物，通过不同剂量分组探讨其对内皮细胞凋亡的作用效果、程度及分子机制，以丰富其在治疗动脉粥样硬化方面的药理机制。
现代研究发现，心血管疾病的发生发展与ERS密切相关。UPR是ERS产生的主要通路之一，我们以Hcy诱导EA.hy926细胞损伤为模型，观察ERS在TSG拮抗血管内皮细胞氧化应激损伤中的作用。结果显示，TSG能降低内质网应激未折叠蛋白反应的关键蛋白GRP78、IRE1α、JNK、CHOP的表达，表明TSG保护内皮细胞免受损伤可能与降低内质网应激的反应程度相关。TSG可能是通过抑制内质网应激，拮抗氧化应激对血管内皮细胞的损伤，为进一步探讨TSG拮抗血管内皮细胞氧化应激损伤的作用及其机制提供了可靠的依据。