补肾软坚方药对动脉粥样硬化模型辅助性T淋巴细胞亚群的干预研究
近年来的研究表明，动脉粥样硬化（AS）是一种自身免疫性疾病，固有免疫与适应性免疫均参与AS的起始与进展，T细胞作为适应性免疫的重要组成部分在其中发挥重要作用。斑块中大多数T细胞为CD4+T细胞，其中辅助性T细胞（helper Tlymphocyte,Th）如Th1、Th2、Th17等均为其重要成分。补肾软坚方药是国医大师阮士怡教授研制的院内制剂，其剂型稳定，质控符合天津市食品药品监督管理局医疗机构制剂标准（TJZB-Z2008110052），临床应用30余年，其治疗动脉粥样硬化性疾病疗效肯定。团队的前期研究表明其对AS模型也具有良好的效果，但其抗AS的机制是否与免疫机制相关尚不清楚。故本研究采用高脂饲料喂养法复制AS兔模型，观察补肾软坚方药对AS模型兔辅助性T淋巴细胞亚群Th1、Th2、Th17水平的影响。
（一）材料与方法
1.实验动物 清洁级健康成年雄性新西兰大白兔24只，体重（2.2±0.2）kg。
2.主要试剂和药品 苏木素-伊红（HE）染色试剂盒，TC试剂盒，TG试剂盒，HDL-C试剂盒，LDL-C试剂盒，T-bet、GATA3、维甲酸相关孤儿受体γ t抗体（RORγ t）的Q-PCR，干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫检测试剂盒，IL-4酶联免疫检测试剂盒，IL-17酶联免疫检测试剂盒。补肾软坚方药，阿托伐他汀钙片。
3.方法
（1）实验分组及干预方法 所有动物予普通饲料适应性喂养1周后，测定体重和血脂，排除饮食异常者，稳定血脂水平和代谢状况。随机分为空白对照组、模型组、补肾软坚方药组（以下简称为补肾软坚组）、阿托伐他汀组，每组6只。空白对照组给予普通饲料喂养直至实验结束，模型组、阿托伐他汀组、补肾软坚组每天给予高脂饲料喂养直至实验结束。空白对照组，每只兔予普通饲料100g/d，并定时予生理盐水灌胃。模型组，每只兔予高脂饲料100g/d，并定时予生理盐水灌胃。阿托伐他汀组，每只兔予高脂饲料100g/d，并定时按5mg/kg·d灌胃，1次/日。补肾软坚组，每只兔予高脂饲料100g/d，并定时按1g/kg·d灌胃，2次/日。
（2）病理组织及标本的采集与保存 12周末将各组实验兔取材，术前12h禁食，自由饮水，活动不受限制。用3%戊巴比妥钠（1mL/kg）经耳缘静脉注射麻醉，新西兰兔取仰卧位固定于手术操作台上，手术器械消毒备用，手术按外科无菌原则操作。分别抽取心腔动脉血并离心取上清液，解剖取出胸主动脉、脾脏保存。
（3）血脂水平检测 用全自动生化分析仪进行血脂水平（总胆固醇TC、总甘油三酯TG、低密度脂蛋白LDL-C、高密度脂蛋白HDL-C）检测。
（4）主动脉病理形态学观察 将胸主动脉进行石蜡切片，行苏木精染色和伊红染色，于光镜下观察。
（5）内中膜面积比测量 运用Image-pro plus 6.0软件测量并计算内中膜面积比以衡量血管增生情况。内中膜面积比（100%）=新生内膜面积／中膜面积，其中，新生内膜面积（Neointimal area，NIA）=内弹力板围绕面积（Internal elastic laminal area,IELA）－管腔面积（Lumen area,LA）；中膜面积（Media area,MA）=外弹力板围绕面积（External elastic laminal area,EELA）－内弹力板围绕面积。
（6）数据检测 分别对脾脏组织T-bet、GATA3、RORγt mRNA水平检测，血浆IFN-γ、IL-4、IL-17水平检测。
4.统计学方法 实验数据统计分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，多组之间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异具有显著性，P＜0.01为差异非常显著。
（二）结果
1.一般情况 实验期间，每组动物每周称取体重1次，观察动物一般情况。空白对照组动物精神佳，毛色光泽度高，捕捉反应敏捷，粪便粒大松软，舌淡红，纳食可，体重随时间变化呈增长趋势；模型组高脂肪喂养后开始出现精神状态差，目光呆滞，捕捉反应迟钝，活动较前减少，眼睛见脂肪沉淀，粪便粒小粘连，舌暗红，纳食可，少数动物出现腹胀、腹泻等症状，需少量而多次投喂。
2.主动脉形态学观察结果
（1）各组兔主动脉内膜标本大体形态学观察 空白对照组主动脉内膜光滑完整、色泽红润、无脂质沉积；模型组主动脉内膜呈瓷白色，可见黄色不规则隆起斑块或黄白色条纹；阿托伐他汀组主动脉内膜可见油脂状物质，表面凹凸不平，突出管腔，较模型组病变程度减轻；补肾软坚组主动脉内膜可见油脂状物质，表面凹凸不平，突出管腔，较模型组病变程度减轻。
（2）各组兔主动脉HE病理形态学改变 本实验通过高脂喂养的方法建立新西兰兔AS模型，12周末进行兔主动脉内膜HE病理形态学观察。空白对照组可见内皮光滑完整，单层紧贴弹力板，中层平滑肌细胞排列整齐，呈梭形或椭圆形，胞浆嗜酸性红染，无泡沫细胞及脂质沉积；模型组可见内膜增生明显，管腔明显变窄，大量泡沫细胞堆积，伴大量巨噬细胞、淋巴细胞等浸润，脂质沉积；阿托伐他汀组可见内膜增生明显，可见脂质沉积，伴大量脂滴及巨噬细胞、淋巴细胞等浸润，与模型组比较，病变程度减轻；补肾软坚组可见内膜增生明显，可见脂质沉积，伴大量脂滴及巨噬细胞、淋巴细胞等浸润，与模型组比较，病变程度减轻。
（3）各组兔主动脉内中膜面积比 如表3-31所示，与空白对照组比较，模型组主动脉内中膜面积比明显增大（P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组主动脉内中膜面积比明显减低（P＜0.01），补肾软坚组主动脉内中膜面积比减低（P＜0.05）。
表3-31 各组实验兔主动脉内中膜面积比（x±s，n=6）
3.血脂水平的表达 与空白对照组比较，模型组TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组TC、TG、LDL-C水平均明显下降，HDL-C水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，补肾软坚组TC、TG、HDL-C、LDL-C差异不显著（P＞0.05）。（见表3-32）
表3-32 各组实验兔血清血脂水平mmol/L（x±s，n=6）
4.脾脏中T-bet、GATA3、RORγt mRNA水平的表达 通过紫外透射仪观察琼脂糖凝胶上PCR产物电泳结果并经凝胶成像系统（UVP）拍照。图片结果采用UVP凝胶成像系统配套Vision Works LS软件进行半定量分析，结果见表3-33。
表3-33 脾脏中T-bet、GATA3、RORγ t mRNA表达水平（x±s，n=6）
通过单因素方差分析及LSD两两分析，与空白对照组比较，模型组脾脏中T-bet mRNA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组脾脏中T-bet mRNA水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，补肾软坚组脾脏中T-bet mRNA水平降低（P＜0.05）；阿托伐他汀组与补肾软坚组脾脏中T-bet mRNA水平比较，差异无统计学意义。（见图3-62）
图3-62 各组实验兔脾脏T-bet mRNA水平比较
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
与空白对照组比较，模型组脾脏中GATA3 mRNA 水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组脾脏中GATA3 mRNA水平显著升高（P＜0.01）；模型组与补肾软坚组、阿托伐他汀组与补肾软坚组脾脏中GATA3 mRNA水平比较，差异均无统计学意义。（见图3-63）
图3-63 各组实验兔脾脏GATA3 mRNA水平比较
注：**P＜0.01。
与空白对照组比较，模型组脾脏中RORγ t mRNA水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组脾脏中RORγ t mRNA水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，补肾软坚组脾脏中RORγ t mRNA水平明显降低（P＜0.01）；阿托伐他汀组与补肾软坚组脾脏中RORγ t mRNA水平比较，差异不显著。（见图3-64）
图3-64 各组实验兔脾脏RORγ t mRNA水平比较
注：**P＜0.01。
5.血浆IFN-γ、IL-4、IL-17 mRNA表达水平 饲养12周后，各组实验兔血浆IFN-γ、IL-4、IL-17水平结果见表3-34。
表3-34 各组实验兔血浆 IFN-γ 、IL-4、IL-17 水平（x±s，n=6）
通过单因素方差分析及LSD两两分析，与空白对照组比较，模型组血浆中IFN-γ水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组血浆中IFN-γ水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，补肾软坚组血浆中IFN-γ水平明显降低（P＜0.01）；阿托伐他汀组与补肾软坚组血浆中IFN-γ水平比较，差异不显著。（见图3-65）
图3-65 各组实验兔血浆IFN-γ水平比较
注：**P＜0.01。
与空白对照组比较，模型组血浆中 IL-4 水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，阿托伐他汀组血浆中 IL-4 水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，补肾软坚组血浆中IL-4水平明显升高（P＜0.01）；阿托伐他汀组与补肾软坚组血浆中 IL-4 水平比较，差异不显著。（见图 3-66）
图 3-66 各组实验兔血浆IL-4水平比较
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
与空白对照组比较，模型组血浆中IL-17水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组血浆中IL-17水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，补肾软坚组血浆中IL-17水平明显降低（P＜0.01）；阿托伐他汀组与补肾软坚组血浆中IL-17水平比较，差异不显著。（见图3-67）
图3-67 各组实验兔血浆IL-17水平比较
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
（三）讨论
AS作为心脑血管疾病的共同病理基础，其预防及治疗的相关研究一直是心血管病研究的重点与热点。在过去的近二十年中，炎症作为AS过程中的重要角色已得到专家们的普遍认可。近年来，大量报道显示免疫细胞是AS病理过程的直接参与者，固有免疫和适应性免疫能在AS中引发炎症，而T细胞在AS病变进展中起着关键作用。新近研究显示，在人体和动物模型AS斑块中大多数T细胞是CD4+T细胞，其中辅助性T淋巴细胞亚群（Th）为其主要成分，Th细胞作为一种重要的免疫调节细胞在免疫系统中发挥重要作用，能迅速分裂并分泌相关细胞因子。根据所产生的细胞因子和效应细胞的生物功能特征，传统上辅助性T淋巴细胞亚群主要分为Th1、Th2和新发现的T淋巴细胞亚群Th17。Th1与Th2细胞之间关系失衡、Th17细胞激活能促进AS斑块的炎症反应并造成斑块不稳定。
T细胞检测多运用流式细胞术，但结合本实验具体情况、实验物种及实验条件限制，未选择流式细胞术作为检测T细胞水平的方法，仅运用Q-PCR法对脾脏中Th1、Th2、Th17各自相关转录因子T-bet、GATA3、RORγ t进行检测，并运用ELISA法对血浆中Th1、Th2、Th17各自相关效应因子IFN-γ 、IL-4、IL-17进行检测。本实验研究结果显示，阿托伐他汀组与补肾软坚组在脾脏中T-bet mRNA水平均较模型组降低；阿托伐他汀组在脾脏中GATA3 mRNA水平较模型组升高，而补肾软坚组与模型组差异不显著；阿托伐他汀组与补肾软坚组在脾脏中RORγ t mRNA水平均较模型组明显降低。此外，阿托伐他汀组与补肾软坚组在血浆中IFN-γ 水平均较模型组降低，IL-4水平均较模型组明显升高，IL-17水平均较模型组明显降低。综上所述，我们推测补肾软坚方药可能通过调控Th1、Th17表达影响AS进程。