补肾软坚方药调控Sirt1-FoxO1通路干预动脉粥样硬化炎症和自噬的研究
随着社会生活水准的不断提升，以冠心病为代表的慢性心脑血管疾病已经成为威胁中老年人身体健康的首要因素。AS作为慢性炎症反应，被认为是冠状动脉粥样硬化性心脏病和心肌缺血的病理基础。本实验通过高脂饮食诱导建立ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型，观察补肾软坚方药对动脉粥样硬化早期小鼠主动脉、血液的影响，并通过免疫组化法检测小鼠主动脉ICAM-1、IL-1β、LC3 B、Sirt1、FoxO1表达的影响，探讨补肾软坚方药通过自噬和炎症反应干预动脉粥样硬化的作用机制。
（一）材料与方法
1.动物 选6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠8只，6周龄健康雄性ApoE-/-小鼠（C57BL/6J背景）24只。
2.主要试剂和药品 辛伐他汀片、补肾软坚方药，Sirt1小鼠单克隆抗体、FoxO1兔单克隆抗体、LC3B兔单克隆抗体、ICAM-1单克隆抗体、IL-1兔多克隆抗体，甘油三酯（TG）测试盒，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测试盒、总胆固醇（T-CHO）测试盒、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测试盒、即用型SABC-POD（兔IgG）试剂盒，DAB显色试剂盒ZLI-9032 3mL（20×）。
3.方法
（1）动物饲养及分组 采用24只C57BL/6J背景来源的ApoE-/-小鼠作为研究对象。随机分为高脂模型组、补肾软坚方药组、辛伐他汀组，3组均给予高脂饮食（21%脂肪和0.15%胆固醇），并以C57BL/6J小鼠作为正常对照组，给予普通饮食（后文中各组相应简称为对照组、模型组、补肾软坚组和辛伐他汀组）。
（2）标本收集处理 各组小鼠于灌胃12周后分别称量体重并记录后处死取材，取材前禁食12h，自由饮水。采用摘眼球取血法取血。常规石蜡包埋，行5μm厚石蜡切片及苏木素-伊红（HE）染色，观察各组小鼠主动脉窦的病理情况。测定生化指标血脂，通过HE染色观察主动脉病理学形态改变，采用免疫组织化学法检测主动脉ICAM1、IL-1β、LC3B、Sirt1及FoxO1表达情况。
4.统计学方法 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组差异采用随机区组设计的单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐时两组间差异采用LSD检验；方差不齐采用Dunnet’s T3法进行两两比较。实验数据采用SPSS 23.0统计软件分析，以P＜0.05为有统计学意义。
（二）结果
1.一般情况 模型组、补肾软坚组、辛伐他汀组三组中的小鼠逐渐出现行动迟缓、懒动、厌食、大便黏腻、被毛稀疏油亮，在12周时最为显著；但与模型组相比，补肾软坚组和辛伐他汀组小鼠整体状态相对较好。
2.补肾软坚方药对高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉窦病理形态学的影响 光镜下观察小鼠主动脉窦HE染色病理结果显示（见附录，图3-29）：对照组主动脉窦内膜光滑无中断，弹性膜结构完整，局部有内膜增生，管腔无扩张充血。模型组主动脉壁内皮受损，局部内膜增生明显且呈不规则排列，向管腔突出，内外弹性膜结构不完整，中膜平滑肌细胞异常增生，排列紊乱，侵入内膜下，形成粥样斑块，内含大量脂质沉积、炎性细胞浸润；补肾软坚组、辛伐他汀组较模型组内膜增厚减轻，斑块面积有所缩小，中膜平滑肌细胞增生较少。
3.补肾软坚方药对动脉粥样硬化小鼠血脂的影响 与对照组比较，模型组TC、TG和LDL-C浓度均明显升高（P＜0.01），而HDL-C浓度降低（P＜0.01）；与模型组比较，补肾软坚组和辛伐他汀组HDL-C浓度明显升高（P＜0.01），辛伐他汀组LDL-C浓度低于模型组（P＜0.05）。（见表3-26，图3-30~图3-33）
表3-26 各组小鼠血脂水平（mmd/L,x±s,n=8）
图3-30 各组小鼠血清TC水平
注：*P＜0.05，** P＜0.01。
图 3-31 各组小鼠血清TG水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
图3-32 各组小鼠血清HDL-C水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
图 3-33 各组小鼠血清LDL-C水平
注；*P＜0.05，**P＜0.01。
4.补肾软坚方药对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠主动脉窦ICAM-1、IL-1β蛋白表达的影响 光镜下观察组织切片免疫组化染色结果（见附录，图3-34）：ICAM-1阳性表达主要在内皮细胞，定位于细胞膜；IL-1β阳性表达主要在单核细胞或巨噬细胞中，定位于细胞质与细胞浆中，两者阳性表达均可见呈棕褐色或棕黄色染色。结果显示，对照组主动脉ICAM-1、IL-1β染色存在一定数量阳性表达细胞，呈散在分布，呈棕褐色。模型组主动脉各蛋白分子阳性表达细胞较对照组均明显增加，胞质/浆内棕褐色强度也明显增加；补肾软坚组和辛伐他汀组较模型组相比，ICAM-1、IL-1β蛋白阳性表达数量有明显减少。
各组阳性表达的平均光密度值（MOD）统计学分析显示：与对照组比较，模型组2种蛋白阳性表达上升（P＜0.01）；与模型组比较，补肾软坚组与辛伐他汀组2种蛋白阳性表达表现出不同程度的降低（P＜0.01）。（见表3-26，图3-35，图3-36）
表3-26 各组小鼠主动脉ICAM-1、IL-1β蛋白表达情况（MOD值，x±s）
图3-35 各组小鼠主动脉ICAM-1蛋白表达水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
图 3-36 各组小鼠主动脉IL-1β蛋白表达水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
5.补肾软坚方药对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠主动脉LC3B蛋白表达的影响 光镜下观察组织切片免疫组化染色结果（见附录，图3-37）：LC3B阳性表达主要见于主动脉血管细胞（主要为内膜层内皮细胞、中膜层平滑肌细胞），细胞浆内可见棕褐色染色。对照组细胞浆内可见散在棕褐色染色分布；与对照自相比，模型组的阳性表达数量减少，细胞浆中棕褐色染色变少；补肾软坚组和辛伐他汀组较模型组阳性细胞数量有所增加，棕褐色染色变多。
各组阳性表达的平均光密度值（MOD）统计学分析显示：与对照组比较，模型组LC3B蛋白阳性表达下降（P＜0.01）；而与模型组比较，补肾软坚组与辛伐他汀组LC3B蛋白阳性表达升高（P＜0.01）。（见表3-27，图3-38）
表3-27 各组小鼠主动脉LC3B蛋白表达情况（MOD值，x±s）
图 3-38 各组小鼠主动脉LC3B蛋白表达水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
6.补肾软坚方药对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠主动脉Sirt1、FoxO1白表达的影响 光镜下观察组织切片免疫组化染色结果（见附录，图3-39）：Sirt1阳性表达广泛存在于多种主动脉血管细胞中，主要见于细胞核；FoxO1主要存在细胞质和细胞核中，而当受到外界刺激后，Sirt1使FoxO1去乙酰化，从而激活FoxO1的活性并向细胞核内部转移。结果表明，对照组细胞核中可见少量Sirt1棕褐色染色，FoxO1在细胞核和细胞质中存在散在棕褐色染色；与对照组相比，模型组的阳性表达数量减少，细胞核和细胞质中棕褐色颗粒变少；补肾软坚组和辛伐他汀组较模型组阳性细胞数量有所增加，Sirt1和FoxO1在细胞核和细胞质内阳性表达增加，棕褐色染色变多。
各组阳性表达的平均光密度值（MOD）统计学分析显示：与对照组比较，模型组2种蛋白阳性表达下降（P＜0.01）；而与模型组比较，补肾软坚组与辛伐他汀组2种蛋白阳性表达表现出不同程度的升高（P＜0.01）。（见表3-28）
表3-28 各组小鼠主动脉Sirt1和FoxO1蛋白表达情况（MOD值，x±s）
经过高脂饮食喂养12周后，与对照组相比，模型组小鼠TC、TG、LDL-C表达明显升高，HDL-C明显降低；主动脉内膜明显增厚并形成AS斑块，炎症相关指标ICAM-1、IL-1β明显升高，自噬蛋白LC3B明显降低，Sirt1、FoxO1蛋白表达下降（P＜0.01）。与模型组相比，补肾软坚方药组和辛伐他汀组能上调HDL-C的水平（P＜0.05或P＜0.01），主动脉病理形态得到改善，较模型组炎症相关指标ICAM-1、IL-1β明显下降，自噬蛋白LC3B 表达升高，Sirt1、FoxO1 蛋白表达升高（P＜0.01）。（见图3-40、图3-41）
图3-40 各组小鼠主动脉Sirt1蛋白表达水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
图 3-41 各组小鼠主动脉FoxO1蛋白表达水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
（三）讨论
肾为先天之本，在调节生命的发育和衰老中具有重要的作用。人到中年，气血虚弱，阴气自半，肾气不足，则易使病邪侵入。
本研究以ApoE-/-小鼠为研究对象，观察补肾软坚方药对高脂饮食诱导的AS小鼠血脂、主动脉的作用效果，并从Sirt1-FoxO1通路探索其对炎症与自噬的影响，初步揭示了补肾软坚方药抗AS的作用机制可能与激活Sirt1-FoxO1通路进而抑制血管炎性反应，增加自噬水平，从而减少细胞内异位脂质沉积相关。同时，本研究仍有许多问题尚待进一步研究。例如：Sirtuins家族有众多的相关因子，其他因子是否能发挥同样的调控作用；Sirtuins家族的其他下游靶基因是否也参与了调控AS形成；此外，本实验仅对补肾软坚方药抗AS的在体实验效应机制进行了探索，并没有定位研究Sirt1-FoxO1通路具体能对哪些血管相关细胞起到调控作用，因此，需要今后在细胞水平进一步研究其具体作用机制。已有大量研究证实，中药能通过多靶向、多途径防控疾病的发生发展，因此，以中医理论为指导，微观与宏观辨证相结合，充分挖掘中医药对AS的理论认识，进一步研究中药及其有效成分防治AS形成的作用机制，将会为AS相关疾病的防治带来新的思路。