氧化/抗氧化系统在家兔动脉粥样硬化建模过程中的调控时效性研究
越来越多的研究表明，在动脉粥样硬化（AS）和急性冠状动脉综合征（ACS）有关的心血管功能障碍的发生发展中，氧化应激（OS）起了重要的作用。机体的氧化应激是指由于氧自由基过量生成、细胞内抗氧化防御系统受损等导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。健康人体内存在着强大的抗氧化酶系统，它们可通过单独或协同作用清除体内氧自由基，从而保护机体免受氧自由基的损伤。当各种原因导致血管内皮损伤时，机体产生过多的氧自由基，为了清除氧自由基，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化物酶在早期代偿性高表达，而后随着氧自由基的进一步产生，抗氧化酶被大量消耗，进而导致机体过量的氧化应激与内源性清除氧自由基的抗氧化系统失去平衡，进一步加剧动脉粥样硬化及相关疾病的发展。本研究以高脂饮食、球囊拉伤及免疫损伤干预日本大耳白兔，动态观察了日本大耳白兔动脉粥样硬化模型建立过程中体内氧化酶的变化，旨在进一步探讨氧化/抗氧化酶系在体内的实时水平，为临床治疗动脉粥样硬化性相关疾病提供思路。
（一）材料与方法
1.材料 动物模型及相关试剂同第三章第一节；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（Nitric oxide，NO）、总抗氧能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒均购自南京建成生物技术有限公司；氧化低密度脂蛋白（oxLDL）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）ELISA试剂盒购自美国R&D公司。
2.分组与建模方法 同第三章第一节。
3.标本采集 所有大耳白兔分别于实验0周、3周、6周、10周末采血。每次采血前禁食12h，经耳缘静脉抽血3mL，静置1h后3000r/min离心10min提取血清，置于－80℃冰箱冻存备用；在第10周末取材，用3%戊巴比妥钠（30mg/mL/kg）麻醉成功后，取出主动脉血管组织，沿纵轴剪开，用生理盐水冲洗后置于10%中性福尔马林固定。
4.实验方法
（1）苏木精-伊红（HE）染色 石蜡切片常规脱蜡至水，苏木精染色5min，自来水冲洗，70%的盐酸乙醇分色30s，水洗后酸化伊红复染10min，水洗、脱水、透明、中性树胶封片。
（2）酶比色法检测 分光光度计检测血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、总抗氧能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）。一氧化氮（NO）用硝酸还原酶法，超氧化物歧化酶（SOD）用黄嘌呤氧化酶法，丙二醛（MDA）用硫代巴比妥酸（TBA）法。
（3）酶联免疫吸附法 氧化低密度脂蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶均采用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA），严格按照试剂盒说明步骤进行。
5.统计学方法 采用SPSS 11.5统计分析软件处理，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析。
（二）结果
1.一般情况 正常组8只，死亡2只；实验组16只，死亡6只；其死亡时间大都集中在4~6周。其他实验动物手术创口愈合良好，未感染任何其他疾病。（见图3-3）
图3-3 正常组与实验组动物体重变化趋势
注：正常组与实验组动物体重随时间变化呈增长趋势，但同一时间点两组间体重比较差别不大，无统计学意义（P＞0.05）。可以证实此干预因素未影响实验兔的正常生长。
2.建模过程中两组家兔血脂变化 实验组血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）随着时间的延长表达水平逐渐升高（P＜0.05或P＜0.01），与同一时间点对照组相比较，在3周、6周、10周时血脂水平差异均有显著性（P＜0.05或P＜0.01），而正常组血脂前后无显著变化。在第10周时，实验组TC和LDL-C均较正常组升高22倍左右。
表3-4 两组在造模过程中的血脂水平观察（x±s，mmol/L）
3.血清SOD、MDA、ox-LDL、NO的变化 两组动物分别在0周、3周、6周、10周末检测ox-LDL、SOD活性、MDA，结果显示：与空白组比较，实验组ox-LDL在3周、6周、10周时水平均明显增长（P＜0.05）；MDA含量逐渐升高，在6周时尤为明显（P＜0.01），3周和10周与空白组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；实验组SOD活力呈逐渐下降趋势，在3周和10周与空白组比较差异有显著性（P＜0.05）。（见图3-4）
图3-4 血清SOD、MDA、ox-LDL、NO的变化
注：NOR表示正常组，CHOL表示实验组。与正常组比较，#P＜0.05，*P＜0.01。
4.10周末血清CAT、T-AOC活性的变化 与正常组比较，实验组CAT、T-AOC活性明显升高（P＜0.01），GSH-Px水平有升高趋势，但差异无统计意义（P＞0.05）。（见图3-5）
图3-5 10周末血清CAT、T-AOC活性的变化
注：NOR表示正常组，CHOL表示实验组；与正常组比较，*P＜0.01。
5.主动脉形态学观察
（1）主动脉大体观察 在第10周末取材中发现正常组的主动脉柔韧均匀，颜色粉红，纵切后肉眼可见内膜光滑鲜亮。而实验组的主动脉粗细不均，血管明显增粗、变脆，外壁黄白相间、凹凸不平，纵切后肉眼可见管壁明显增厚、黄白色条纹或大小不等的黄白色脂质斑块向血管表面隆起。（见附录，图3-6）
（2）图像分析 苏丹Ⅲ染色见实验组主动脉壁大部分被染成深红色，正常组主动脉内膜光滑，无深红色的病变区；切片分析结果显示（见附录，图3-7、图3-8；见表3-5），实验组主动脉中膜厚度无明显变化，与正常组比较差异无统计意义（P＞0.05）；但实验组内膜明显增厚（P＜0.01），内膜中膜厚度比、内膜增生指数增加与正常组比较有统计意义（P＜0.01）。
表3-5 两组间内膜厚度、中膜厚度及内膜中膜厚度比、内膜增生指数的比较（x±s）
（三）讨论
高脂饲料加球囊拉伤建立腹主动脉、髂动脉AS模型及颈总动脉狭窄的模型广泛应用于AS的研究。另有报道用高脂饲料加炎症刺激及注射牛血清白蛋白诱导制作此病理模型，本实验模拟人AS发病机制综合多种因素，以高脂饲喂叠加免疫生物损伤和内皮损伤的复合因素干预日本大耳白兔。研究显示，实验组动物TC、TG、LDL-C水平随着时间的延长均呈上升趋势（P＜0.05或P＜0.01），在第3周时血脂水平大幅升高，可能与第2周末注射牛血清白蛋白有关，经第4周末球囊拉伤后，在三种损伤的综合作用下，第10周末实验组TC和LDL-C较正常组升高22倍左右，经多角度评价认为，典型的动脉粥样硬化家兔模型已经形成。氧化应激与AS的发生密切相关，贯穿了AS的全过程，自动脉脂质条纹形成开始，到严重病变处斑块破裂。SOD活性的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力，MDA是脂质过氧化反应的主要代谢产物，本研究提示家兔AS建立过程中，MDA产物呈时间依赖性增多，SOD总体活力呈下降趋势，但在第6周时间点时较第3周时间点活力强，可能是由于动脉内膜经球囊破坏后，内皮细胞代偿性产生了更多的SOD以对抗活性氧对血管内皮的损伤。T-AOC反映机体防御系统抗氧化能力的强弱，CAT是抗氧化应激酶系的重要成员之一，第10周末实验组CAT、T-AOC活性明显升高（P＜0.01）。此结果提示，AS后即使SOD等抗氧化酶活力下降，但抗氧化体系依然活跃。ox-LDL是低密度脂蛋白的氧化产物，它可激活内皮细胞，增强细胞黏附分子的表达，从而促进单核巨噬细胞的黏附和浸润，同时可刺激单核巨噬细胞表达基质金属蛋白酶，增加纤维帽内细胞外基质降解，削弱纤维帽抗损伤能力，使斑块易损性增加。另外，ox-LDL还可进一步加剧血管粥样病变的炎症反应。
在AS的发病过程中，SOD清除氧自由基的能力降低，导致氧自由基大量蓄积，破坏细胞膜的生物功能，导致细胞损伤老化，氧化应激作用增强，MDA等毒性物质的产生增多，修饰LDL形成ox-LDL，而ox-LDL则激活炎性因子引起内皮的损伤。GSHPx是机体抗氧化酶系统的一种酶，在细胞质中直接参与清除H2O2，减少羟自由基的产生，也可使脂质过氧化物分解从而减轻其毒性，GSH-Px易受氧自由基攻击而失活，有研究表明，在ApoE敲除的小鼠中，GSH-Px基因的缺失加剧了AS的发病，而C57BL/J6系小鼠敲除GSH-Px基因却没有增加AS病变。研究还发现，在高脂加球囊拉伤及免疫损伤导致的AS病变中，GSH-Px水平仅有升高趋势，与正常组比较，差异并无显著性（P＞0.05）。
本实验结果显示，AS兔模型体内存在着明显的脂质过氧化损伤。血脂水平大幅上升，ox-LDL、MDA血清含量呈时间依赖性增加，SOD血清含量降低，但实验组10周末CAT、T-AOC活性明显升高（P＜0.01），这可能是CAT、T-AOC的代偿性表达所致，GSH-Px水平可能在AS发病的氧化应激机制中不具有关键作用。研究进一步提示，动脉粥样硬化后机体发生的氧化应激可能在早期有一个代偿性高表达的过程，抗氧化系统可能存在应激保护时间窗。