补肾软坚方药影响缺氧内皮细胞NO和ET-1合成与释放的研究
一氧化氮（NO）和内皮素（ET-1）主要是由血管内皮细胞分泌的一对作用相反的血管活性分子，NO和ET-1不仅是生理状态下血管张力及其他心血管功能的调控者，而且也是多种心血管疾病（如动脉粥样硬化）病理过程的参与者。内皮型一氧化氮与内皮素的平衡失调即一氧化氮合成和释放减少（或一氧化氮合成酶的活性下降）与内皮素合成与释放的异常增加，与动脉粥样硬化的形成有密切的关系。团队以往的临床研究表明，补肾软坚方药可益肾健脾、软坚散结，具有对抗实验性动脉粥样硬化形成、改善动脉粥样硬化患者临床症状和体征、降低血栓素/前列环素（TXB2/PGI2）比值、改善垂体性腺轴功能等作用，但该方药对内皮细胞功能的影响尚不明确。为了探讨该方药对缺氧内皮细胞的作用，团队就该方药对缺氧内皮细胞一氧化氮、内皮素合成与释放及基因影响进行了研究。
（一）材料与方法
1.实验动物 普通级雄性日本大耳白兔，体重（2.2±0.2）kg。
2.试剂与药品 维生素C，Factor Ⅷ Related Ag，内皮细胞生长因子，TryPsinEDTA液，谷氨酰胺。
3.方法
（1）补肾软坚方药含药血清的制备 同第二章第三节。
（2）造模 取新生胎儿脐静脉，冲洗后用0.1%胶原酶37℃消化15分钟，收集消化液，离心，弃上清液，用完全培养液使细胞悬浮，种于培养瓶中，置于37℃、5%C02培养箱中，次日换液，5~7天，待内皮细胞铺满瓶底，用胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%∶0.02%）消化，使细胞悬浮，置于新的培养瓶中。采用Ⅷ染色方法鉴定内皮细胞。
（3）分组及给药 内皮细胞的缺氧造模。将培养的第3代细胞随机分为空白组（K组）、缺氧组（Q组）、中药组、西药组（X组），每组各6孔，每孔细胞数5×104个；分别依次加入56℃灭活的10%的空白兔血清、10%的空白兔血清、10%含中药补肾软坚方药兔血清、10%含维生素C兔血清。除空白组外，其余各组通高纯氮气（95%N2+CO25%）4小时。
4.标本检测项目 吸出各组细胞培养液，测定一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、内皮素（ET）水平。NO的测定按Griess法，550nm、0.5cm光经测定NO产量。以样品中亚硝酸盐NO2含量代表NO的生成量，操作按试剂盒说明进行。NOS的测定在530nm波长下，测定吸光度，根据光度的大小测出NOS活力，结果以U/mL表示，操作方法按试剂盒说明进行。ET活性的测定用放射免疫方法，按试剂盒说明操作。
5.统计学方法 所测各组NO、NOS活性、ET值用方差分析和q检验。
（二）结果
1.造模后内皮细胞形态观察 含10%空白兔血清空白组内皮细胞没有任何变化；缺氧组、含维生素C兔血清的西药组及含中药兔血清中药组，通高纯氮气（95%N2+CO25%）4小时后，缺氧组细胞收缩变小，核浓缩；西药组、中药组细胞肿胀，但中药组较西药组程度轻。（见附录，图4-1）
2.缺氧内皮细胞NO、NOS、ET的表达 缺氧4小时能抑制内皮细胞NO释放，补肾软坚方药和抗氧化剂维生素C能抑制缺氧诱导的内皮细胞NO的释放减少，中西药作用的差异没有显著性。缺氧4小时能抑制内皮细胞NOS活性，补肾软坚方药和抗氧化剂维生素C能抑制缺氧诱导的内皮细胞NOS活性下降，中西药作用的差异没有显著性。但补肾软坚方药组与缺氧组差异没有显著性（P＞0.05）。以上结果说明，缺氧4小时能促进内皮细胞ET大量释放，补肾软坚方药能抑制缺氧诱导的内皮细胞ET的释放，维生素C不能抑制缺氧诱导的ET释放。（见表4-1）
表4-1 补肾软坚方药对缺氧内皮细胞NO释放、NOS活性和ET释放的影响（x±s，n=6）
图4-2 对缺氧内皮细胞NO释放的影响
图 4-3 对缺氧内皮细胞NOS释放的影响
图4-4 对缺氧内皮细胞ET释放的影响
（三）讨论
近年来，人们对内皮细胞的研究和认识不断深化，人们已经认识到血管内皮是非常重要的内分泌腺，内皮源性收缩因子（Endothelium-derived contracting factor，EDCF）与内皮源性舒张因子（Endothelium-derived relaxing factor，EDRF）的分泌和调节功能平衡失调，是内皮功能异常和内皮细胞损伤的重要特征，也是许多心血管疾病病理过程中基本的病理表现。治疗性干预心血管系统内分泌紊乱，使EDCF和EDRF处于相对平衡状态，能有效抑制心脏和血管结构的重塑，明显改善高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭等心血管疾病患者的预后和生存质量。NO是一种小分子的生物活性物质，是体内重要的血管舒张因子，生理状态下能扩张血管、抑制血小板聚集和白细胞黏附，有效拮抗血管和心肌结构重塑，病理状态下能损伤组织细胞。NOS存在于多种细胞内，分布于血管内皮细胞膜上者称内皮型一氧化氮合酶（eNOS），是NO合成的关键限速酶。内皮素是体内最强的血管收缩因子，并能促进血管平滑肌的增殖和心肌肥大，是参与心血管系统结构重塑的重要因子。因此，阻抑一氧化氮与内皮素合成与释放的异常，对预防心血管疾病的发生发展具有积极作用。
低氧（缺氧）对机体是一种异常的刺激，是常见的心脑血管疾病的一个病理性刺激因素，可引发一系列病理反应。低氧时血管内皮细胞是组织中受攻击的第一道靶器官，内皮受损后，其释放的重要血管内皮衍生舒张因子NO严重减少，而ET-1释放增加，从而使内皮依赖性舒张功能受限。NO等舒张因子在一定程度上可抑制内皮素及其他血管收缩因子的分泌。血管内皮细胞严重缺氧后，细胞能量代谢发生障碍，细胞内酸中毒，细胞膜通透性增加，使细胞内ET-1大量释放入血，结果血浆ET-1水平显著增加；同时，由于细胞内ET-1减少和缺氧的刺激，进一步激活ET-1 mRNA表达，使ET-1合成不断增加。
本研究发现，内皮细胞缺氧的同时，分别给予补肾软坚方药和抗氧化剂维生素C，能显著抑制NOS活性降低和NO释放减少，从而抑制ET-1的释放，且中药的作用更加明显，说明补肾软坚方药通过上述途径对内皮细胞的保护作用可能是其抗动脉粥样硬化作用的机制之一。