补肾软坚方药调节脾Th1干预ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的机制研究
动脉粥样硬化是中老年人普遍存在的一种病变，也是多种心脑血管疾病发生的病理基础，目前的普遍观点认为AS是一种“炎症免疫性疾病”。脾脏是机体重要的免疫器官，是机体细胞免疫和体液免疫中心。最近研究证实，AS是Th1占主导的自身免疫状态。而对于临床治疗AS有效的补肾软坚方药，本团队从炎症、细胞凋亡、氧化应激及抗硝基化等多个角度进行了研究，发现补肾软坚方药在早期可通过对抗炎症、内质网应激等来对抗AS的发展。以补肾软坚方药为干预手段，以脾Th1适应性免疫为切入点，探讨补肾软坚方药是否通过调节脾Th1适应性免疫来抑制AS的发生发展，从而为中医药治疗AS提供新思路及实验依据。
（一）材料与方法
1.实验动物 6周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠24只，体质量（23.27±1.31）g；6周龄雄性ApoE-/-小鼠（C57BL/6J背景）72只，体质量（22.63±1.40）g。
2.主要试剂与药品 辛伐他汀片，补肾软坚方药，甘油三酯（TG）测试盒，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测试盒，总胆固醇（T-CHO）测试盒，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测试盒，AngⅡ酶联免疫检测试剂盒，Trizol溶液，cDNA第一链合成试剂盒，SYBR Green试剂盒，DNA/RNA共提取试剂盒。
3.方法
（1）分组给药 将24只C57BL/6J野生型小鼠作为对照组，72只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、补肾软坚组、辛伐他汀组，每组24只。对照组予以普通饮食，其余三组高脂饮食喂养，补肾软坚组同时以补肾软坚方药（2340mg·kg-1·d-1）0.2mL灌胃给药，辛伐他汀组予辛伐他汀（2.6mg·kg-1·d-1）等量灌胃给药，其余两组等量蒸馏水灌胃。
（2）取材 分别于第4周、8周、12周三个时间点各组取8只小鼠处死，取血并摘取主动脉，称重后置于中性福尔马林中固定备用。取脾脏组织，于4℃生理盐水中冲洗，滤纸吸干，称重后迅速置于液氮中冻存。取材完毕，迅速将血清和主动脉、脾脏组织转移至－80℃冰箱保存备用，选取12周主动脉和脾脏组织进行RNA检测。
4.标本检测项目
（1）酶联免疫吸附法（ELISA）检测Ang Ⅱ的表达 使用Ang Ⅱ ELISA试剂盒检测，按说明书进行操作。对血清中血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）的含量进行检测。采用摘眼球取血法，血液于室温放置30min后，3000r/min离心15min，收集上层血清转移至离心管中，置于－80℃冰箱保存备用。
（2）RT-qPCR检测脾脏组织GM-CSF、主动脉组织T-bet、IFN-γ基因表达Trizol试剂盒提取脾脏组织总RNA，紫外分光光度仪测mRNA的含量、纯度，用逆转录试剂盒转录成cDNA，以GAPDH为内参，以扩增片段与GAPDH的灰度比值表示产物多少，进行半定量。95℃变性15s，60℃退火/延伸1min，40个循环。目的基因及内参基因引物序列见表3-35。
表3-35 目的基因及内参基因引物序列
根据RT-qPCR原始检测结果，采用2-ΔΔCt法进行数据的相对定量分析，ΔΔCt=（待测样品目的基因平均Ct值－待测样品内参基因平均Ct值）－（对照样品目的基因平均Ct值－对照样品内参基因平均Ct值）。
5.统计学方法 计量资料数据均以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（One way-ANOVA）。运用IBM SPSS Statistics 22软件进行数据处理，P＜0.05为差异有统计学意义。
（二）结果
1.小鼠脾重量和脾指数 实验表明各个时间点，模型组脾重量、脾指数均高于正常组。用补肾软坚方药干预后，脾重量和脾指数都较模型组降低，在第12周时有统计学意义。辛伐他汀干预在第4周、12周时有统计学意义；第8周时有降低趋势，无统计学意义。提示补肾软坚方药可能在一定程度上干预脾免疫来对抗AS病变形成，第12周时效果优于第4周、8周。因此，在之后的Th1适应性免疫通路的探讨中选取第12周这一时间点。（见表3-36、表3-37，图3-68、图3-69及附录图3-70）
表3-36 各组小鼠脾重量变化情况（mg，x±s，n=8）
表3-37 各组小鼠脾指数变化情况（mg/g，x±s，n=8）
图3-68 各组小鼠脾重量变化情况
注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
图3-69 各组小鼠脾指数变化情况
注：与对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
2.AngⅡ的表达 模型组AngⅡ浓度在第4周、8周、12周呈现递增的形式。在第8周时辛伐他汀组AngⅡ数值低于模型组，具有统计学意义（P＜0.05）。随着药物干预时间的增加，从第8周开始，补肾软坚方药降低AngⅡ的作用开始显效，第12周时有统计学意义。提示补肾软坚方药对AS的干预作用主要是通过降低AngⅡ浓度。（见表3-38，图3-71）
表3-38 各组小鼠血清 AngⅡ浓度变化情况（ng/L，x±s，n=8）
图3-71 各组小鼠血清AngⅡ浓度
注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
3.脾GM-CSF mRNA，主动脉T-bet、IFN-γ mRNA的表达 从表3-39、表3-40可以看出，与对照组比较，模型组及给药组脾中GM-CSF mRNA及主动脉T-bet、IFN-γ mRNA的表达均升高。补肾软坚方药干预后，GM-CSF、T-bet、IFN-γ mRNA的表达都有一定程度降低。初步表明补肾软坚方药可能通过影响脾Th1免疫途径而影响AS病变程度，首先降低脾中GM-CSF的产生，影响IRA B细胞对树突状细胞的作用，进而导致Th1细胞的减少，分泌IFN-γ的作用减弱，减轻病变程度。（见图3-72、图3-73和图3-74）
表3-39 各组小鼠脾组织GM-CSF mRNA相对表达水平（x±s，n=6）
表3-40 各组小鼠主动脉组织T-bet、IFN-γ mRNA相对表达水平（x±s，n=6）
图3-72 各组小鼠脾脏组织GM-CSF mRNA相对表达水平
注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
图3-73 各组小鼠主动脉组织T-bet mRNA相对表达水平
注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
图3-74 各组小鼠主动脉组织 IFN-γ mRNA 相对表达水平
注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05。
（三）讨论
固有免疫与适应性免疫均参与AS的起始与进展，T细胞作为适应性免疫的重要组成部分在其中发挥重要作用。有研究发现，ApoE-/-小鼠脾中CD8+、CD25+T细胞对免疫信号起抑制作用，转录CD8+、CD25+T细胞到ApoE-/-小鼠能抑制脾CD4+T细胞增殖，减少AS病变。
本实验运用Real-time PCR法对脾脏中GM-CSF及主动脉中Th1转录因子T-bet和效应因子IFN-γ的mRNA表达情况进行检测。结果显示，ApoE-/-小鼠高脂饮食饲养后，脾中GM-CSF mRNA及主动脉T-bet、IFN-γmRNA的表达均升高。补肾软坚方药干预后，GM-CSF、T-bet、IFN-γmRNA的表达都有一定程度降低。初步表明补肾软坚方药可能是通过影响脾Th1免疫途径而影响AS病变程度，首先降低脾中GM-CSF的产生，影响IRA B细胞对树突状细胞的作用，进而导致Th1细胞减少，分泌IFN-γ的作用减弱，减轻病变程度，从一个较新的角度阐释了补肾软坚方药治疗AS的药理机制。