补肾软坚方药早期干预对ApoE-/-小鼠主动脉及肾保护作用的 机制研究
动脉粥样硬化（AS）是一种常见的心血管疾病，是血管壁的退行性病变，常累及大中动脉，是发达国家高疾病死亡率的重要原因之一。随着对动脉粥样硬化机制的不断研究发现，除了脂质代谢失衡和动脉脂质积聚，免疫炎症反应也是导致动脉粥样硬化发生和发展的主要因素。既往研究已证实，补肾软坚方药治疗AS性疾病疗效肯定，但补肾软坚方药早期用药能否保护组织器官从而起到有效的、预防性的治疗作用有待进一步明确。本文通过补肾软坚方药早期干预ApoE-/-小鼠主动脉及肾脏组织，为补肾软坚方药治疗AS的药理机制拓宽了新的认知。
（一）材料与方法
1.实验动物 选取清洁级6周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠8只，体重（22.66±0.94）g，清洁级6周龄雄性ApoE-/-小鼠（C57BL/6J背景）24只，体重（22.35±1.35）g。
2.主要试剂与药品 辛伐他汀片，补肾软坚方药，即用型SABC-POD（兔IgG）试剂盒，Beclin-1抗体（ab55878），LC3β抗体（L7543），兔单抗Bcl-2（ab32124）。
3.方法
（1）造模分组 将8只C57BL/6J野生型小鼠作为对照组，24只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、补肾软坚组、辛伐他汀组，每组8只。对照组喂以普通饲料，同时每只小鼠每日灌胃等量蒸馏水。余3组予高脂饮食，同时模型组，每只小鼠给予蒸馏水灌胃0.2mL/次，补肾软坚组给予补肾软坚方药2.34g·kg-1·d-1灌胃0.2mL/次，辛伐他汀组给予辛伐他汀2.6mg·kg-1·d-1灌胃0.2mL/次。
（2）取材 各组小鼠于灌胃12周后摘除眼球取血，血液于室温放置30min后，3000r/min离心15min，收集上层血清转移至离心管中，置于－80℃保存备用。取血后取主动脉和肾脏组织，于4℃生理盐水中清洗血液，滤纸吸干，称重后置于中性福尔马林中固定，备用。
4.标本检测项目
（1）形态学观察 常规石蜡包埋，行5μm厚石蜡切片及HE染色，观察各组小鼠主动脉和肾组织的病理情况。
（2）标本Beclin-1、LC3β和Bcl-2免疫组化检测 石蜡切片脱蜡至水，30%H202溶液1份与蒸馏水9份混合，PBS洗涤3次，柠檬酸钠热修复，滴加5%BSA封闭液静置20min，滴加一抗（Beclin-1按1∶500稀释；LC3β按1∶500稀释；Bcl-2按1∶200稀释），4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，滴加二抗，室温30min，PBS洗涤3次，滴加试剂SABC，37℃，20min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，脱水封片，显微镜观察。
（3）Beclin-1、LC3β、Bcl-2蛋白免疫组化半定量分析 应用Image-Pro Plus version 6.0图像分析软件，以400倍摄取图像，选定阳性区域测定主动脉和肾组织中阳性表达的Beclin-1、LC3β和Bcl-2积分光密度值总和（Integral Optical Density,IOD）（Sum），进行半定量分析，每张切片测量5个不重叠视野，并测定每个视野下选定的阳性区域的面积（Area）（Sum），计算平均光密度值（Mean Optical Density,MOD）[MOD=IOD（Sum）/Area（Sum）]，取平均值，并进行统计学分析。
5.统计学方法 计量资料数据均以均值±标准差（x±s）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析（One way ANOVA），首先对数据进行方差齐性检验，方差齐则用LSD法；方差不齐则用Dunnet’s T3法进行两两比较。运用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行数据处理，P＜0.05为差异有显著性。
（二）结果
1.形态学改变 小鼠主动脉及肾组织的HE染色光镜下观察，发现主动脉及肾组织对照组无明显异常改变，模型组改变显著，补肾软坚组和辛伐他汀组病变程度较模型组轻。表明补肾软坚方药早期干预能够延缓AS性疾病进程，对高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠主动脉和肾具有保护作用。
2.免疫组化法测量主动脉和肾组织中Beclin-1、LC3β、Bcl-2的表达 主动脉三种蛋白阳性表达主要位于主动脉血管细胞（见表3-50，图3-120、图3-121和图3-122），肾组织三种蛋白阳性表达主要位于肾小管上皮细胞和肾间质细胞的胞浆中（见表3-51，图3-123、图3-124和图3-125）。与对照组相比，模型组3种蛋白阳性表达下降，补肾软坚组和辛伐他汀组较模型组蛋白阳性表达增加。自噬相关蛋白Beclin-1、LC3β、Bcl-2的表达较模型组均升高。研究表明，补肾软坚方药可以促进肾组织自噬活动并抑制细胞凋亡。（见附录，图3-126，图3-127）
表3-50 各组小鼠主动脉Beclin-1、LC3β和Bcl-2蛋白表达情况（MOD值，x±s，n=8）
图3-120 各组小鼠主动脉Beclin-1蛋白表达情况
注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
图3-121 各组小鼠主动脉LC3β蛋白表达情况
注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。
图3-122 各组小鼠主动脉Bcl-2蛋白表达情况
注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05。
表3-51 各组小鼠肾组织Beclin-1、LC3β和Bcl-2蛋白表达情况（MOD值，x±s，n=8）
图3-123 各组小鼠肾组织Beclin-1蛋白表达情况
注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
图3-124 各组小鼠肾组织LC3β蛋白表达情况
注：与对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.01。
图3-125 各组小鼠肾组织Bcl-2蛋白表达情况
注：与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.01。
（三）讨论
自噬和凋亡是广泛存在于细胞中的生命活动调节机制，在AS发生发展中具有重要作用，研究药物干预细胞自噬和凋亡途径，对防治AS具有重要意义。既往研究已证实补肾软坚方药治疗AS性疾病疗效肯定，通过调节氧化应激和炎症反应而抑制实验性AS动物主动脉斑块生长、内膜厚度、增生指数，并对脑组织具有保护作用。但补肾软坚方药早期用药能否起到有效的、预防性的治疗作用及能否通过调控自噬和凋亡途径以保护组织器官，有待进一步明确。
采用ApoE-/-小鼠高脂喂养和给药同步进行的方式进行实验研究，用免疫组化法检测主动脉和肾组织中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3β和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，发现补肾软坚组中三者较模型组均升高，表明补肾软坚方药可以促进主动脉和肾组织自噬活动，并抑制凋亡活动，这是其发挥组织保护作用的可能机制。自噬可以调节脂质代谢，但脂质超载将抑制自噬，补肾软坚方药干预可以改善高脂诱导的自噬抑制，早期干预对高脂饮食诱导的动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠的血液、主动脉和肾等方面具有保护作用，且对主动脉和肾的保护作用可能是通过调控自噬和凋亡相关蛋白Beclin-1、LC3β、Bcl-2的表达而实现。这些为补肾软坚方药防治动脉粥样硬化理论提供了实验证据。