补肾软坚方药基于TLR4/NF-κB通路干预ApoE-/-小鼠内皮细胞自噬的研究
动脉粥样硬化（AS）作为临床常见心脑血管疾病的病理基础，严重危害人类的健康，始终是医学研究的热点。AS以慢性炎症反应为主要特征，主要累及大中型动脉。由于AS发生发展的复杂性，其发病机制尚不完全明确，存在多种学说。目前研究者多从炎症学说、氧化应激学说、脂质浸润学说、免疫功能异常学说等角度进行研究。大量研究表明，淋巴细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞共同参与的血管壁免疫炎症反应均与AS的发生发展密切相关。因此，调控机体的免疫炎症反应，抑制促炎介质的产生是干预动脉粥样硬化及防治心脑血管事件发生的重要靶点。研究初步探讨补肾软坚方药对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型内皮细胞自噬的影响，以及TLR4/NF-κB通路与自噬的相关性。
（一）材料与方法
1.实验动物 选用雄性清洁（SPF）级8周龄ApoE-/-（C57BL/6背景）小鼠30只，雄性C57BL/6小鼠10只，体重（23±2）g。
2.主要试剂与药品 甘油三酯（TG）测试盒，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测试盒，总胆固醇（T-CHO）测试盒，即用型SABC-POD（兔IgG）试剂盒，兔抗小鼠LC3B抗体，兔多抗SQSTM1/P62抗体，大鼠抗小鼠CD31抗体，兔抗小鼠TLR4抗体，FITC标记兔抗大鼠IgG二抗，TRITC标记兔IgG二抗，兔多抗Phospho-NF-kBP65抗体。
3.方法
（1）造模 所有动物高脂饮食喂养 12 周后，剔除血脂水平正常者。
（2）分组给药 实验动物分4组，对照组随机选取C57BL/6小鼠10只，普通饮食喂养；模型组随机选取10只ApoE-/-小鼠，高脂饮食，第6周末开始予生理盐水0.2mL/只/日灌胃；阿托伐他汀组随机选取10只ApoE-/-小鼠，高脂饮食，第6周末开始予阿托伐他汀0.2mL/只/日灌胃，剂量3mg/kg/d。补肾软坚组随机选取10只ApoE-/-小鼠，高脂饮食，第6周末开始予补肾软坚方药0.2mL/只/日灌胃，剂量1.365g/kg/d。各组均于第12周末取材。
（3）取材 进行末次干预后禁食12h，采用摘眼球法留取血液标本，静置1h后3000r/min离心15分钟取血清，进行总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）、IL-1β的含量测定，测前于－80℃冰冻保存。取心脏放入4%多聚甲醛内浸泡固定，该组织用于主动脉根部TLR4、NF-κB、LC3B、P62的检测。
4.标本检测项目
（1）血脂指标检测 采用全自动生化分析仪测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。
（2）ELISA检测IL-1β及脂联素水平 釆用血清酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组小鼠炎症因子IL-1β及脂联素水平。严格按照ELISA试剂盒说明书操作，待显色终止后即刻测量OD450的数值，并绘制标准曲线及计算样品浓度。
（3）常规形态学检查 心脏放入4%多聚甲醛内浸泡固定常规脱水包埋，切片厚5μm，行HE染色。利用图像分析系统（Image-pro plus 6.0 System）对内弹力层围绕面积与血管腔横截面积进行测定，以内弹力层围绕面积代表内膜面积，计算内膜与血管腔面积比率，代表内膜增厚程度。
（4）免疫组织化学染色 石蜡切片脱蜡至水，30% H2O2室温10min，蒸馏水洗3次，柠檬酸盐抗原修复，滴加5%BSA封闭液，室温20min，滴加一抗，4℃过夜后，37℃，30min，PBS洗涤3次，滴加HRP标记的二抗，37℃，30min，PBS洗涤，滴加试剂SABC，37℃，30min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，脱水封片，显微镜观察。
（5）免疫荧光染色法 石蜡切片脱蜡至水，柠檬酸盐抗原修复，滴加5%BSA封闭液，室温，20min，滴加一抗，4℃过夜后，37℃，30min，PBS洗涤3次，滴加二抗（1∶200稀释）37℃，60min，PBS洗涤，滴加试剂DAPI复染10min，PBS冲洗，封片，荧光显微镜下观察拍照。
5.统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，两组间数据比较采用t检验（t-test）；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），首先对数据进行方差齐性检验，方差齐则用LSD法，方差不齐则用Dunnet’s T3法进行两两比较。数据以均值±标准差（x±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。
（二）结果
1.小鼠血脂水平检测结果 与对照组相比，模型组、阿托伐他汀组和补肾软坚组小鼠血清TC、TG水平均升高，差异非常显著（P＜0.01），HDL-C水平降低，差异非常显著（P＜0.01）；与模型组相比，阿托伐他汀组、补肾软坚组血清TC、TG水平均降低，差异非常显著（P＜0.01），阿托伐他汀组HDL-C水平升高，差异具有显著性（P＜0.05），补肾软坚组HDL-C水平升高，差异非常显著（P＜0.01）（见表3-45，图3-104）。以上结果表明补肾软坚方药可有效改善小鼠血脂水平。
表3-45 小鼠血脂水平结果（mmol/L，x±s）
图3-104 各组小鼠血脂水平
注：与对照组相比，aP＜0.01；与模型组相比，bP＜0.05，cP＜0.01。
2.主动脉病理学变化 HE染色结果显示（见附录，图3-105），对照组小鼠主动脉窦无异常改变；模型组小鼠主动脉窦可见明显动脉粥样硬化斑块；阿托伐他汀组小鼠主动脉窦可见少量斑块，内皮下间隙可见少量脂质沉积、少量泡沫细胞和炎症细胞，中膜层平滑肌细胞排列相对整齐；补肾软坚组小鼠主动脉窦可见少量斑块，内膜下间隙存在脂质沉积、少量泡沫细胞和少量炎症细胞。与对照组相比，模型组小鼠主动脉内膜血管腔面积比值显著升高，表明内膜明显增生，差异非常显著（P＜0.01）；与模型组相比，阿托伐他汀组内膜血管腔面积比值显著降低，表明内膜增生程度减轻，差异非常显著（P＜0.01），补肾软坚组内膜血管腔面积比值降低，差异有显著性（P＜0.05）（见表3-46，图3-106）。表明补肾软坚方药干预后内膜增生程度减轻。
表3-46 小鼠主动脉内膜增生程度（%，x±s）
图3-106 小鼠主动脉内膜增生程度
注：与对照组相比，aP ＜0.01；与模型组相比，bP＜0.01，cP＜0.05。
3.免疫组化及免疫荧光检测小鼠主动脉TLR4、P-NF-κB/P65的表达结果 TLR4阳性表达为黄色或棕色颗粒。与对照组相比，模型组小鼠TLR4表达水平明显升高，差异非常显著（P＜0.01）；与模型组相比，阿托伐他汀组、补肾软坚组主动脉TLR4表达水平下降，差异具有显著性（分别为P＜0.01，P＜0.05）（见表3-47，图3-107，附录图3-108）。免疫荧光染色观察NF-κB活化后核转位量化水平。对照组中无表达，与对照组相比，模型组NF-κB核转位程度明显增高，差异非常显著（P＜0.01）；与模型组相比，阿托伐他汀组、补肾软坚组主动脉NF-κB核转位程度明显降低，表明补肾软坚方药下调了主动脉NF-κB水平，差异具有显著性（分别为P＜0.01，P＜0.05）（见附录图3-109，图 3-110）。
表3-47 小鼠主动脉TLR4、P-NF-κB/P65的表达（%，x±s）
图3-107 小鼠主动脉TLR4的表达
注：与对照组相比，aP ＜0.01；与模型组相比，bP＜0.01，cP＜0.05。
图3-110 小鼠主动脉P-NF-κB/P65的表达
注：与对照组相比，aP＜0.01；与模型组相比，bP＜0.01，cP＜0.05。
4.免疫组化及免疫荧光检测小鼠主动脉及内皮细胞LC3β、P62的表达结果 LC3β阳性表达为绿色点状聚集，P62阳性表达为绿色荧光，均表达于细胞质中。主动脉及内皮细胞均无LC3β、P62表达，与对照组相比，模型组LC3β、P62的阳性表达明显增加，差异非常显著（P＜0.01）；与模型组相比，阿托伐他汀组、补肾软坚组小鼠主动脉及内皮细胞LC3β点状聚集明显增多，但是P62阳性表达均明显减少，差异有显著性（P＜0.05）（见表3-48）。表明补肾软坚方药干预后，LC3β的表达上调，P62的表达下调，且主动脉与内皮细胞表达趋势相同。（见图3-111、图3-112，附录图3-113、附录图3-114，图3-115、图3-116，附录图3-117、附录图3-118）
表3-48 小鼠主动脉、内皮细胞LC3β的表达水平（x±s）
图3-111 小鼠主动脉LC3β的表达水平
注：与对照组相比，aP＜0.01；与模型组相比，bP＜0.05。
图3-112 小鼠内皮细胞LC3β的表达水平
注：与对照组相比，aP＜0.01；与模型组相比，bP＜0.05。
图3-115 小鼠主动脉P62的表达水平
注：与对照组相比，aP＜0.01；与模型组相比，bP＜0.01，cP＜0.05。
图3-116 小鼠内皮细胞P62的表达水平
注：与对照组相比，aP＜0.01；与模型组相比，bP＜0.01，cP＜0.05。
5.ELISA法检测小鼠血清IL-1β表达 结果显示，与对照组相比，模型组血清IL-1β表达水平明显升高，差异非常显著（P＜0.01）；与模型组相比，阿托伐他汀组及补肾软坚组血清IL-1β表达水平明显下降，差异非常显著（P＜0.01）。表明补肾软坚方药干预后，炎症因子IL-1β表达下降。（见图3-119）
表3-49 小鼠血清 IL-1β 的表达水平（pg/mL，x±s）
图3-119 小鼠血清IL-1β的表达水平
注：与对照组相比，aP＜0.01；与模型组相比，bP＜0.01。
（三）讨论
近些年研究表明，自噬在动脉粥样硬化中的各阶段发挥的作用不同，对于细胞的生存与死亡具有双向作用，自噬的过度抑制或激活都将加快AS的发展。但多数研究结果显示，在AS中自噬是细胞存活的一种自我保护机制。尤其在AS早期，自噬通过降解有害物质保护细胞免受氧化应激，适当地诱导自噬可以减缓动脉粥样硬化的发生发展。TLR4作为架接固有免疫和适应性免疫的桥梁，是AS中最重要的模式识别受体。TLR4活化后激活TRIF依赖型NF-κB，产生大量炎症因子如IL-1β、TNF-α等。
本研究通过高脂喂养ApoE-/-小鼠导致小鼠主动脉内膜增厚，并最终形成动脉粥样硬化斑块。补肾软坚方药干预后，小鼠内膜增厚程度小于模型组，血清TC、TG、LDL-C水平下降，HDL-C水平升高；主动脉TLR4阳性颗粒表达面积低于模型组，P-NF-κB核转位程度低于模型组；主动脉及内皮细胞自噬标记蛋白LC3点状分布高于模型组，P62蛋白表达水平低于模型组；血清IL-1β浓度低于模型组。研究证实了补肾软坚方药可通过TLR4/NF-κB信号通路下调促炎因子IL-1β的表达，抑制动脉粥样硬化炎症；补肾软坚方药可通过上调主动脉及内皮细胞自噬，抑制动脉粥样硬化发展，其机制可能与TLR4/NF-κB信号通路相关。