补肾软坚方药对兔一氧化氮、脂质过氧化产物及超氧化物歧化酶的干预
本研究从动脉粥样硬化氧化应激状态入手，观察补肾软坚方药对实验性动脉粥样硬化家兔血脂、一氧化氮、脂质过氧化产物及超氧化物歧化酶等影响，明晰其作用机理。
（一）材料与方法
1.主要试剂与仪器 血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）试剂盒（南京建成生物技术有限公司）；NF-κB免疫组化试剂盒（美国CHEMICON公司）；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）ELISA试剂盒（美国RB公司）；200型半自动生化分析仪（荷兰威图公司）；OLYMPUS-BX40生物显微镜（BX40，日本奥林巴斯公司）；HMIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统（武汉同济医科大学千屏影像工程公司）。
2.药物 补肾软坚方药（主要药物组成：党参、丹参、杜仲、桑寄生、龟甲、淫羊藿、何首乌、石菖蒲、茯苓、砂仁、夏枯草、海藻等，0.5g/片，60片/瓶，天津中医药大学第一附属医院制剂，批号：071105）； 辛伐他汀（40mg/片，5片/盒，Meck sharp&Dohme Ltd.U.K 生产，杭州默沙东制药有限公司分装，批号：07283）。
3.实验方法
（1）动物分组 选用普通级雄性日本大耳白兔36只，北京市维同利华实验动物中心提供，SCXK京2007-0001，体重（2.2±0.2）kg。所有动物给予普通饲料适应性饲养1周，然后随机分为正常对照组6只，模型组10只，补肾软坚组10只，辛伐他汀组10只。所有动物单笼饲养，饮水不限，自由摄食，每日每只给予150g饲料；对照组动物给予普通饲料，其他组给予高脂饲料，共9周，第10周取材。
（2）造模和给药方法 造模方法：同第三章第一节。给药方法：给予高脂饮食的同时，给药组分别给予辛伐他汀5mg/kg/次，1次/d；补肾软坚方药1g/kg/次，2次/d。
（3）血清学指标检测 分别于实验开始及第3、6、10周进行采血，采血前禁食12h，然后经耳缘静脉抽取空腹血3mL，静置1h后3000r/min离心10min，取血清于－80℃冻存待用。TG、TC以酶比色法，LDL-C、HDL-C以可见光匀相清除法，采用半自动生化分析仪测定。NO用硝酸还原酶法，SOD采用黄嘌呤氧化酶法，MDA用硫代巴比妥酸（TBA）法，ox-LDL用ELISA方法检测，步骤严格按照说明书进行。
（4）病理检测 第10周取材，用3%戊巴比妥钠（30mg/mL/kg）麻醉成功后，取出主动脉血管组织，沿纵轴剪开，生理盐水冲洗后置于10%中性福尔马林固定，进行苏丹Ⅲ染色，分析斑块面积占内膜面积的百分比；然后改刀、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜观察病理改变并进行图像分析。测量计算内膜中膜厚度比（IT/MT）、纤维帽厚度与内中膜厚度比（FCT/IMT）及内中膜面积比值即内膜增生指数（IHI）。
（5）免疫组织化学检测 选取与病理图像分析所用切片相邻的切片用免疫组化方法检测NF-κB阳性表达。步骤：脱蜡→0.01mol PBS洗3次→3%过氧化氢封闭→0.01mol PBS洗3次→打孔液打孔10min→蒸馏水冲洗，0.01mol PBS洗3次→微波枸橼酸热修复→冷却至室温→5%兔血清封闭液封闭45min→4℃过夜→滴加一抗NFkB P65→4℃取出，复温20min→滴加二抗→37℃孵育→0.01mol PBS洗3次→DAB显色→苏木素复染，自来水冲洗→分化液分化，自来水冲洗→返蓝→中性树胶封片→显微镜下观察。每只动物选取3张切片，每张切片随机观察5个不同的高倍镜视野（40×），计算阳性细胞的面积占内膜面积的百分比，取其平均值。
（6）统计学方法 实验数据计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（SPSS 11.5统计软件），差异显著性水平设为a=0.05。
（二）结果
1.各组血脂水平变化的比较 表3-6显示，与正常对照组比较，模型组TC、TG、LDL、HDL呈增长趋势（P＜0.05或P＜0.01）。给药组与模型组比较，辛伐他汀在第3周时对血脂具有明显降低作用，与模型组比较有统计意义。补肾软坚方药对血脂的影响主要在于调脂，在第6周时对HDL-C的升高作用，与模型组比较有统计意义。
表3-6 各组血脂水平变化情况（mmol/L）（正常对照组n=6，其他组n=10）
2.补肾软坚方药对SOD、MDA、ox-LDL、NO水平的影响 表3-7显示，与正常对照组比较，模型组SOD水平在第3、10周时降低，NO水平在第3、10周时增高，至第10周时，此水平大幅增加；MDA、ox-LDL水平在各时间点均增高（P＜0.05或P＜0.01）。给药组与模型组比较，补肾软坚组SOD水平在第3、10周时高于模型组；NO水平在第6周时高于模型组，第10周时低于模型组；MDA水平在第3、6、10周时均低于模型组；ox-LDL水平在第3周时低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。辛伐他汀组MDA水平在第3、6周时水平低于模型组；NO水平在第10周时低于模型组（P＜0.05或P＜0.01），其余效果不显著。可见与辛伐他汀比较，补肾软坚方药在调节SOD和NO水平方面具有一定优势。
表3-7 在不同时间点各组SOD、MDA、NO、ox-LDL水平变化（正常对照组n=6，其他组n=10）
3.NF-κB阳性表达面积比较 正常对照组血管壁见少量NF-κB阳性表达，胞核内见少量不均匀的黄褐色沉淀物，阳性染色面积与内膜面积比是0.012±0.006。模型组血管壁平滑肌细胞、内皮细胞的胞核有较多表达，在胞质内也有少量阳性表达，阳性染色面积与内膜面积比是0.162±0.046（P＜0.01）。辛伐他汀组与补肾软坚组在内皮细胞和平滑肌细胞有少量表达，阳性染色面积与内膜面积比分别是0.107±0.049、0.111±0.038，均低于模型组，有统计学差异（P＜0.01），给药组间无统计学差异。
4.各组IT/MT、IHI、斑块面积与内膜面积比、纤维帽厚度 如表3-8所示，IMT的比较给药组斑块面积与内膜面积比、IT/MT、内膜增生指数低于模型组、FCT/IMT高于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。给药组之间无统计学差异。
表3-8 各组IT/MT、IHI、斑块面积/内膜面积、FCT/IMT比较（%）（x±s，n=10）
（三）讨论
氧化应激与AS的发生密切相关，贯穿了AS的全过程。NF-κB的异常激活是引起炎症或氧化损伤的关键步骤，因而控制NF-κB的异常激活是治疗AS的重要策略。本实验AS兔模型的动脉壁组织NF-κB呈高表达，补肾软坚方药对其表现出明显抑制作用，与对照药辛伐他汀作用相当，两者之间无统计学意义。
在AS的发病过程中，SOD清除氧自由基的能力降低，导致氧自由基大量蓄积，破坏细胞膜的生物功能，导致细胞损伤老化；氧化应激作用增强，MDA等毒性物质产生增多，修饰LDL形成ox-LDL。ox-LDL激活炎性因子引起内皮损伤，中断NO的受体后信号传递，直接降解和灭活NO，引起局部血管收缩，血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和血小板黏附聚集；加之被氧化的脂质沉积于动脉壁并被巨噬细胞吞噬形成泡沫细胞，使脂核增大，内膜增厚，从而使纤维帽变薄，加快AS的发病进程。可见，体内过氧化产物是影响斑块面积、内膜和纤维帽厚度的重要因素之一。本实验结果显示，AS兔模型病理分析显示内膜增厚、纤维帽变薄；体内存在着明显的脂质过氧化损伤，内皮功能紊乱。血脂水平上升，ox-LDL、MDA血清含量呈时间依赖性增加，SOD血清含量呈时间依赖性降低，NO呈现上升-降低-再上升的波浪形。在造模因素干预后，机体保护性反应致使NO含量稍有增加；随着干预因素对机体的不断刺激，至6周时NO水平低于正常对照组水平；至10周时，远远超过正常对照组水平。在生理状态下，NO可防止内皮损害，体现其保护作用。病理情况下，NO过高会对机体产生负面影响，可产生细胞毒素、致癌等病理作用。NO毒性作用机制主要为：NO作用于铁蛋白，影响细胞呼吸及能量代谢，参与过氧化脂质的形成；加速过氧亚硝基阴离子（ONOO－）及羟自由基（·OH）等氧化剂的生成，引起细胞损害，致使细胞死亡。所以，10周时过高的NO水平不仅对机体没有保护作用，反而加重了脂质过氧化对机体的损伤。
影响斑块不稳定的另一重要因素是纤维帽厚度，本实验兔AS模型主动脉内膜明显增厚、斑块面积增大、纤维帽变薄，增加了斑块的不稳定性。而补肾软坚方药可防止纤维帽变薄，控制斑块发展，从而有效保护动脉壁。此保护作用可能与抗脂质过氧化有关。实验结果显示，补肾软坚方药可减少MDA和ox-LDL的生成，增强SOD活力，清除氧自由基，减轻脂质过氧化损伤，延缓ox-LDL对组织的损伤，从始动环节抑制动脉粥样硬化斑块的形成；而且能够调节NO水平，使之维持在一定范围内，改善内皮功能状态；下调氧自由基激活转录调控因子NF-kB及相关炎症因子的表达，从而在保护血管内皮细胞中起重要作用。尤其在升高SOD和NO水平方面，补肾软坚方药优于辛伐他汀，可见补肾软坚方药在提高机体保护性因素方面具有一定优势；其祛邪扶正兼顾，通过加强机体正气，提高HDL、SOD和NO水平，来抵抗邪气，降低血脂水平，抗脂质过氧化，从而实现抗AS、稳定AS斑块的作用。这与中医对本病的病因病机认识及以此制定的治疗法则是一致的。
中医对本病病因病机的认识是虚、瘀、毒。虚即脾肾两虚，瘀即血瘀，毒即痰毒和热毒。脂质过氧化形成的氧化物可能是痰毒血瘀的物质基础。因此，通过“益肾健脾、软坚散结”疗法，运用具有健脾益肾、涤痰降浊、活血散结之功效的补肾软坚方药，不仅可以使各种血管活性物质在体内的表达及比例正常，而且可以使内皮功能得以恢复，以此达到抗氧化、保护血管内皮、稳定AS斑块的作用。